PRAME mRNA和SOX9 mRNA在肺腺癌中的表達及臨床意義*

韓文慧，鄧慧蘭，王 輝，何萌萌

青島市膠州中心醫院呼吸一科，山東青島 266300

肺癌是臨床常見呼吸系統惡性腫瘤，發病原因復雜，起源于支氣管黏膜或腺體，早期無明顯臨床癥狀，70%以上的患者確診時已發展為中晚期，占我國惡性腫瘤死亡原因首位[1]。黑色素瘤特異性抗原(PRAME)是一種表面抗原，基因定位于染色體22q11上，編碼509個氨基酸的蛋白質，與惡性血液性疾病及多種實體腫瘤的發生、發展、預后密切相關[2-3]。性別決定基因盒9(SOX9)是SOX家族研究最為廣泛的一員，基因定位于染色體17q24.1～q25.1區域內，包含3個外顯子及2個內顯子，在胚胎、性腺發育中起重要作用，且與多種腫瘤的發生、發展有關[4-5]。本研究主要探討PRAME mRNA和SOX9 mRNA在肺腺癌中的表達及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2018年4月在本院接受手術治療的肺腺癌患者73例為研究對象，其中男性41例，女性32例，年齡41～67歲，平均(57.61±8.23)歲。均于術中收集肺腺癌癌組織及癌旁正常組織標本，并立即置液氮中速凍，于-80 ℃冰箱保存。根據病理分級分為：高分化10例，中分化32例，低分化31例；根據《國際肺癌研究協會第八版國際肺癌TNM分期》[6]分為：Ⅰ期12例，Ⅱ期34例，Ⅲ期27例；根據有無淋巴結轉移分為：無淋巴結轉移44例，有淋巴結轉移29例；根據腫瘤大小分為：腫瘤直徑<3 cm者38例，腫瘤直徑≥3 cm者35例。納入標準：(1)接受根治性手術切除；(2)術后病理確診為原發性肺腺癌；(3)術前未接受放療、化療、免疫治療、靶向治療；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)未經病理學證實；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并心、肺、腎等臟器嚴重疾?。?4)認知障礙或因其他原因無法配合定期隨訪。根據隨訪結果將研究對象分為預后良好組(62例)、預后不良組(11例)。預后良好組男性34例，女性28例；年齡43～66歲，平均(57.65±7.62)歲。預后不良組男性7例，女性4例；年齡41～67歲，平均(57.38±7.15)歲。預后良好組與預后不良組性別、年齡相比，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院倫理委員會批準，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1PRAME mRNA、SOX9 mRNA表達的檢測 采用實時熒光定量PCR檢測肺腺癌癌組織及癌旁正常組織中PRAME mRNA、SOX9 mRNA的表達。采用Trizol法提取組織中總RNA，反轉錄為cDNA，進行PCR擴增反應。PRAME正向引物：5′-CTG TAC TCA TTT CCA GAG CCA GA-3′；反向引物：5′-TAT TGA GAG GGT TTC CAA GGG GTT-3′。內參基因β-actin正向引物：5′-TCG TCG ACA ACG GCT CCG GCA TGT-3′；反向引物：5′-CAT TGT AGA AGG TGT GGT G-3′。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環，72 ℃延伸5 min。SOX9正向引物：5′-GCG TAT GAA TCT CCT GGA CC-3′；反向引物：5′-GCG GCT GGT ACT TGT AAT CC-3′。內參基因GAPDH正向引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′；反向引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環。引物及試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司，操作嚴格按照說明書進行，采用2-ΔΔCt法計算PRAME mRNA、SOX9 mRNA的相對表達水平。根據癌旁正常組織PRAME mRNA、SOX9 mRNA相對表達水平的中位數將癌組織PRAME mRNA、SOX9 mRNA分為高、低表達。

1.2.2隨訪 以肺腺癌患者術后第1天作為隨訪起點，以電話、門診、住院的方式進行為期24個月的隨訪，術后1年內每3個月進行1次隨訪，之后每6個月隨訪1次，以肺腺癌患者腫瘤復發或發生死亡為終點事件，隨訪截止日期為2020年4月30日，隨訪終點為出現終點事件或隨訪期滿。出現終點事件者納入預后不良組，未出現者納入預后良好組。

2 結 果

2.1不同組織PRAME mRNA、SOX9 mRNA表達比較 與癌旁正常組織相比，肺腺癌癌組織PRAME mRNA的相對表達水平降低(P<0.05)，SOX9 mRNA的相對表達水平升高(P<0.05)。見表1。

2.2肺腺癌癌組織PRAME mRNA、SOX9 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 肺腺癌癌組織PRAME mRNA、SOX9 mRNA表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)，與病理分級、臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表2。

表1 不同組織PRAME mRNA、SOX9 mRNA的相對表達水平比較

表2 肺腺癌癌組織PRAME mRNA、SOX9 mRNA表達與臨床病理特征的關系

2.3肺腺癌癌組織PRAME mRNA表達與SOX9 mRNA表達的相關性 Spearman相關分析結果顯示，肺腺癌癌組織PRAME mRNA表達與SOX9 mRNA表達呈負相關(r=-0.559，P<0.001)。見圖1。

2.4PRAME mRNA、SOX9 mRNA表達與肺腺癌患者的預后關系分析 與預后良好組相比，預后不良組肺腺癌患者PRAME mRNA的相對表達水平降低(P<0.05)，SOX9 mRNA的相對表達水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 預后良好組、預后不良組肺腺癌患者PRAMEmRNA、SOX9 mRNA的相對表達水平比較

2.5影響肺腺癌患者預后的危險因素分析 以肺腺癌患者預后狀況作為因變量(預后良好賦值為0，預后不良賦值為1)，以PRAME mRNA、SOX9 mRNA、病理分級、臨床分期、淋巴結轉移作為自變量進行COX回歸分析，將PRAME mRNA高表達、SOX9 mRNA低表達、高中分化、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移均賦值為0，PRAME mRNA低表達、SOX9 mRNA高表達、低分化、臨床分期Ⅲ期、有淋巴結轉移均賦值為1。COX單因素分析結果顯示，PRAME mRNA表達、SOX9 mRNA表達、病理分級、臨床分期、淋巴結轉移差異均有統計學意義(P<0.05)；COX多因素分析結果顯示，PRAME mRNA低表達、SOX9 mRNA高表達、低分化、臨床分期Ⅲ期、有淋巴結轉移均是影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4、5。

圖1 肺腺癌癌組織PRAME mRNA表達與SOX9 mRNA表達相關性散點圖

表4 影響肺腺癌患者預后危險因素的單因素分析結果

表5 影響肺腺癌患者預后危險因素的多因素分析結果

3 討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，可根據生物學特性分為小細胞肺癌、非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占肺癌發病率的75%～80%，包括腺癌、鱗癌及大細胞癌3種病理類型，其中肺腺癌占比超過50%[7-8]。近年來，肺腺癌診斷及治療方案不斷發展、進步，但預后效果仍不理想，肺腺癌患者5年生存率僅為4%～17%[9]，因此，越來越多的研究致力于尋找有效的生物標志物及潛在治療靶點，以期提高生存率。

PRAME于1997年在黑色素瘤患者中被首次發現，能夠被細胞毒性T細胞特異性識別并使腫瘤溶解，是腫瘤睪丸抗原家族的一員。PRAME可參與調控細胞周期及細胞增殖、凋亡過程，與血液系統疾病的關系研究較多，在慢性粒細胞白血病加速期的早期階段即有增高現象，且早于白血病細胞數的增多，可能成為疾病進展的生物標志物[10-11]。PRAME已被報道與肺癌關系密切，不同病理類型的肺癌存在不同的治療靶點，對肺腺癌有效的靶向藥物可能對肺鱗癌無效，PRAME在肺癌中的表達情況也因病理類型不同存在差異[3,12]。王芳等[3]研究發現，原發性肺腺癌患者癌組織PRAME表達較癌旁正常組織低，且與患者病情嚴重程度相關。雄英等[12]通過高通量轉錄組測序結果發現，與癌旁正常組織相比，肺鱗癌癌組織中PRAME為高表達，可能為肺鱗癌的靶向治療提供參考依據。本研究發現，與癌旁正常組織相比，肺腺癌癌組織PRAME mRNA的相對表達水平降低，提示PRAME mRNA可能參與肺腺癌的發生；進一步研究發現，PRAME mRNA表達與肺腺癌患者病理分級、臨床分期、淋巴結轉移有關，提示PRAME mRNA可能參與肺腺癌的病情進展；與預后良好組相比，預后不良組PRAME mRNA的相對表達水平降低，提示低表達的PRAME mRNA可能與不良預后有關，可能成為肺腺癌的預后標志物。

SOX家族是一類參與早期胚胎發育的核轉錄因子，有20多個功能相似的成員，均含有保守基因序列，可以特異性結合DNA。近年來，SOX家族在惡性腫瘤診斷、治療方面的臨床應用潛力受到越來越多的關注[13-16]。王征等[17]研究發現，甲狀腺癌癌組織中SOX9表達較癌旁正常組織高，且與臨床分期、包膜浸潤、淋巴結轉移有關，對甲狀腺癌患者預后生存狀況也有一定評估價值。劉艷玲等[18]研究發現，SOX9在口腔鱗癌癌組織中呈高表達，與腫瘤體積、臨床分期、淋巴結轉移及患者存活率均有關，可能成為口腔鱗癌臨床病情及預后的有效標志物。鄧程偉等[19]通過在肺腺癌細胞中轉染SOX9小干擾RNA1使SOX9實現低表達，轉染后細胞與未轉染細胞相比增殖活性降低，細胞凋亡率增高，提示下調SOX9可對肺腺癌細胞的增殖產生抑制作用，促進其凋亡進程。本研究結果顯示，與癌旁正常組織比較，肺腺癌癌組織SOX9 mRNA的相對表達水平升高，且其表達與患者病理分級、臨床分期、淋巴結轉移均有關，提示SOX9 mRNA可能參與肺腺癌的發生、發展；Spearman相關分析結果顯示，肺腺癌癌組織PRAME mRNA表達與SOX9 mRNA表達呈負相關，提示SOX9 mRNA可能通過下調PRAME mRNA的表達參與肺腺癌的病情變化；與預后良好組比較，預后不良組SOX9 mRNA的相對表達水平升高，提示SOX9 mRNA可能與患者預后狀況有關。COX回歸模型分析結果顯示，PRAME mRNA低表達、SOX9 mRNA高表達、低分化、臨床分期Ⅲ期、有淋巴結轉移均是影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素，可能為肺腺癌患者預后狀況的評估提供一定參考。

綜上所述，PRAME mRNA、SOX9 mRNA與肺腺癌患者的病情進展密切相關，可用于臨床評估患者病情，同時，PRAME mRNA低表達、SOX9 mRNA高表達是影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素，可用于患者預后風險評估，有助于及時進行干預以提高患者預后狀況。但本研究也存在一定不足，僅對肺腺癌癌組織中PRAME mRNA、SOX9 mRNA表達及關系做了初步分析，未對其具體機制進行深入研究，另外樣本量少也可能導致結果存在一定偏差，后續工作將以此為重點展開。