血清miR-21、sICAM-1和CA153聯合檢測對乳腺癌的早期診斷價值*

汪曉曼，朱怡恬，葉莉莉，蘇亞娟

1.南京醫科大學附屬婦產醫院/南京市婦幼保健院檢驗科,江蘇南京 210009;2.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科,黑龍江哈爾濱 150081

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，全世界每年新增病例約138萬，近年其發病率呈逐年升高的趨勢，世界衛生組織公布的統計數據顯示，乳腺癌已成為全球女性的首發惡性腫瘤[1]。文獻報道，早期乳腺癌預后較好，但晚期乳腺癌因發生淋巴結和血行轉移，預后較差，因此，乳腺癌的早期診斷對提高乳腺癌的療效、改善預后具有重要意義[2-3]。乳腺癌的診斷臨床常采用活組織檢測，但因其具有侵入性、存在取樣誤差和患者依從性差等缺點難以開展[4]。目前血清腫瘤標志物的檢測已成為乳腺癌早期診斷的重要輔助手段之一，受到臨床的廣泛重視，且每一種腫瘤標志物都有其獨特的優勢和局限性，合理利用能優勢互補，提高乳腺癌的診斷率[5]。本研究對血清中非編碼小RNA分子miR-21、可溶性細胞間黏附分子1(sICAM-1)和糖類抗原153(CA153)聯合檢測在乳腺癌早期診斷中的應用價值進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年12月在南京醫科大學附屬婦產醫院診斷為乳腺癌的患者31例作為惡性腫瘤組，年齡35～77歲，平均(53.13±4.65)歲，術后病理TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期9例，Ⅲ期13例，Ⅸ期2例。選擇同期在南京醫科大學附屬婦產醫院活組織檢測為乳房良性病變患者31例作為良性腫瘤組，年齡37～79歲，平均(54.16±4.92)歲；選擇同期在南京醫科大學附屬婦產醫院體檢健康者31例作為健康對照組，年齡36～76歲，平均(52.48±5.27)歲。3組受試者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經南京醫科大學附屬婦產醫院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 血清CA153檢測采用瑞士羅氏e601電化學發光微粒子儀及匹配的試劑，以上項目通過室間質評及性能驗證；血清sICAM-1檢測試劑盒由CUSABIO公司提供。RNA提取試劑盒由美國Invitrogen公司提供，SYBR Green熒光染料試劑盒購自瑞士羅氏公司，PCR引物由上海昕浩生物設計、合成。

1.3方法

1.3.1血清標本的分離 所有患者抽取空腹靜脈血5 mL，室溫靜置20 min，以3 000 r/min離心20 min進行血清分離，于-20 ℃冰箱保存，所有標本避免脂血、溶血和黃疸。

1.3.2血清CA153和sICAM-1檢測 血清CA153的檢測采用電化學發光微粒子法，血清sICAM-1的檢測采用酶聯免疫吸附試驗雙抗體夾心法。以上各指標的檢測均嚴格按照試劑說明書及《全國臨床檢驗操作規程》第4版[6]進行。

1.3.3血清miR-21檢測 采用實時熒光定量PCR，通過標準曲線計算血清miR-21水平。采用苯酚氯仿法提取血清中總RNA，反轉錄成cDNA，采用SYBR Green法檢測血清miR-21水平，上游引物5′-TGC GGT AGC TTA TCA GAC TG-3′，下游引物5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。反應體系：MgCl21.20 μL，PCR緩沖液2.00 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.40 μL,Taq酶0.30 μL，探針和引物0.33 μL，cDNA 1.00 μL，加ddH2O至總反應體積20.00 μL。反應條件：94 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣品設3個復孔，同時以ddH2O 設為陰性對照。

1.3.4計算公式 靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，陰性預測值=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，陽性預測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%，診斷效率=真陽性+真陰性/(真陽性+假陽性+真陰性+假陰性)×100%。

2 結 果

2.13組血清miR-21、sICAM-1、CA153水平比較 血清miR-21、sICAM-1、CA153水平在良性腫瘤組與健康對照組比較，差異無統計學意義(t=1.261、1.319、1.685，均P>0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153水平在惡性腫瘤組明顯高于良性腫瘤組，差異有統計學意義(t=2.876、2.651、5.394，均P<0.05)。見表1。

表1 3組血清miR-21、sICAM-1、CA153水平比較

2.23種生物學標志物單項或聯合檢測對乳腺癌的早期診斷效能 本研究數據顯示，血清miR-21、sICAM-1、CA153聯合檢測早期診斷乳腺癌的靈敏度、陽性預測值和診斷效率與miR-21單項檢測比較，差異有統計學意義(χ2=5.383、6.653、4.391，均P<0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153聯合檢測早期診斷乳腺癌的靈敏度、陰性預測值、陽性預測值和診斷效率與sICAM-1單項檢測比較，差異有統計學意義(χ2=7.715、4.310、5.922、4.257，均P<0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153聯合檢測早期診斷乳腺癌的靈敏度、特異度、陰性預測值、陽性預測值和診斷效率與CA153單項檢測比較，差異有統計學意義(χ2=7.715、6.945、5.107、12.37、7.461，均P<0.05)。見表2。

分別繪制血清miR-21、sICAM-1、CA153單項和聯合檢測對乳腺癌早期診斷的ROC曲線，結果顯示，miR-21、sICAM-1、CA153單項檢測早期診斷乳腺癌的ROC曲線下面積分別為0.739(95%CI：0.604～0.874)、0.723(95%CI：0.591～0.854)、0.767(95%CI：0.633～0.902)，而血清miR-21、sICAM-1、CA153聯合檢測早期診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.891(95%CI：0.792～0.991)。見圖1。

表2 3種生物學標志物單項或聯合檢測對乳腺癌的早期診斷效能(%)

圖1 血清miR-21、sICAM-1、CA153單項和聯合檢測早期診斷乳腺癌的ROC曲線

3 討 論

近年來隨著生命科學技術的迅猛發展，一類在進化上高度保守、在基因轉錄后水平實現負向調控基因的miRNA的研究在各個領域最為活躍，極大拓寬了人們對生物發育、疾病發生、發展的認識[7]。在哺乳動物基因組中，成熟的miRNA基因調控著超過30%的基因表達或蛋白合成[8]，因此,miRNA 在不同疾病及病理進程中具有特定的表達譜，已經在多種腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥等多種疾病的診斷和預后中顯示了重要價值[9]。miRNA不僅在組織中穩定表達，并且在血清中具有較高的穩定性和特異度，因此，有望成為早期診斷腫瘤的無創新型生物學標志物[10]。

多種惡性癌組織中miRNA的表達與腫瘤的發生、發展密切相關，miR-21作為miRNA中研究的熱門原癌基因，被視為一種理想的腫瘤生物學標志物[11]。miR-21已被發現在多種血液系統和實體器官的惡性腫瘤中發揮重要作用，是目前唯一發現的在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌和食管癌中均高表達的miRNA，也是第一個可以在腫瘤患者血清中檢測到的miRNA，因此，在miRNA的研究領域中，miR-21的作用不容忽視[12]。文獻報道顯示，miR-21在乳腺癌早期患者血清中顯著升高，提示miR-21在乳腺癌的早期診斷中具有一定的臨床價值，且相對于早期乳腺癌患者，晚期患者miR-21升高更為顯著，因此，miR-21與乳腺癌的臨床分期密切相關[13]。本研究結果顯示，miR-21在惡性腫瘤組均明顯高于良性腫瘤組。但基于miR-21表達具有廣譜性，將miR-21單項檢測用于乳腺癌早期診斷，特異度較低，因此，本研究將miR-21與sICAM-1、CA153聯合檢測，以提高臨床對于乳腺癌早期診斷的特異度。sICAM-1作為介導細胞間黏附的黏附分子，與其配體結合可介導腫瘤細胞與不同細胞、基質的黏附，以此促進腫瘤的侵襲和轉移。研究顯示，sICAM-1在肝癌組織中表達顯著增加，水平與腫瘤的大小、包膜的完整性密切相關，且有轉移組sICAM-1水平顯著高于無轉移組，sICAM-1已作為預測肝癌轉移、復發和預后的重要生物學指標[14]。亦有研究發現，sICAM-1在乳腺癌組織中的表達強度和陽性率明顯高于相應的正常乳腺組織[15]，與本研究對sICAM的檢測結果高度一致，提示本研究選擇將sICAM-1作為乳腺癌早期診斷的指標之一切實可行。CA153作為公認的乳腺癌相關抗原，不僅用于乳腺癌的監測和篩查，還可作為乳腺癌骨轉移及預后的標志物[16]，但單獨將CA153作為乳腺癌早期診斷的標志物尚存在片面性。因此，本研究將血清miR-21、sICAM-1、CA153聯合檢測用于乳腺癌的早期診斷，其靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷效率較單項檢測均顯著提高，分別為87.1%、90.3%、93.3%、81.8%、89.2%，且聯合檢測早期診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.891，說明聯合檢測對乳腺癌的早期診斷有重要臨床價值。本研究不足之處在于納入的樣本量相對較少，后續研究中，將采取前瞻性研究，擴大臨床樣本量，進一步確定適合本地區特色的乳腺癌早期診斷模式。