子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平變化及其臨床意義*

袁 媛,韓大鵬,胡 麗

1.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院，上海 201415；2.上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，上海 200000；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200021

子癇前期是一種常見妊娠并發(fā)癥，在全球圍產(chǎn)期孕婦中其發(fā)病率為5%～8%，且呈逐步升高趨勢，每年有超過76 000例孕婦和500 000例胎兒因子癇前期死亡[1]。子癇前期發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳、環(huán)境及心理被認(rèn)為是其發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素，隨著分子診斷技術(shù)及理論的不斷發(fā)展，微小RNA(miRNA)的表達(dá)變化或其調(diào)控通路的改變也被認(rèn)為與子癇前期的發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)[2]。miRNA是一組內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，其長度通常為22個(gè)核苷酸，miRNA自身并不編碼蛋白質(zhì)，而是通過與其他基因結(jié)合對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控[3]。miRNA可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程，在機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)、腫瘤發(fā)生及免疫等過程中發(fā)揮重要作用，惡性腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等中均發(fā)現(xiàn)miRNA異常分布，miRNA在這些疾病發(fā)生過程中具有調(diào)控作用[3-5]。已有研究報(bào)道，miRNA在子癇前期患者胎盤組織中呈異常表達(dá)[6]，但胎盤組織miRNA檢測只能在產(chǎn)后進(jìn)行，并不能預(yù)先對(duì)該病進(jìn)行診斷與預(yù)判。由于miRNA可以經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入母體外周血，且在外周循環(huán)中高度穩(wěn)定，使得血清miRNA可能作為無創(chuàng)診斷、監(jiān)測子癇前期的潛在生物標(biāo)志物。曾辛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在孕婦胎盤組織高表達(dá)可能與重度子癇前期發(fā)病相關(guān)。本研究主要探討血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平變化及聯(lián)合檢測的臨床意義，以期為子癇前期無創(chuàng)檢測、診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018 年7月至 2019 年10月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院就診的子癇前期患者60例，根據(jù)《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》[7]中關(guān)于子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分為輕度子癇前期患者(輕度組，28例)及重度子癇前期患者(重度組，32例)。另選擇同期體檢健康妊娠孕婦58例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象既往無高血壓、其他心血管疾病、糖尿病及腎臟疾病等慢性疾病史，無乙醇或藥物濫用史，無吸毒史，無前置胎盤、胎盤早剝、流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血壓檢測 收集3組研究對(duì)象的年齡、孕周、孕次、產(chǎn)次等，采用水銀血壓計(jì)(魚躍醫(yī)療)測量所有研究對(duì)象的血壓，測量前靜坐，期間禁飲濃茶、咖啡等，以3次測量結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。

1.2.2標(biāo)本收集 每位研究對(duì)象在首次入院時(shí)采集空腹靜脈血2管，每管5 mL，其中一管不添加抗凝劑，靜置20 min后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃凍存?zhèn)溆?miRNA檢測)；另一管采用肝素抗凝，靜置10 min后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清-20 ℃保存?zhèn)溆?生化指標(biāo)檢測)。收集研究對(duì)象24 h蛋白尿，以二甲苯防腐，取標(biāo)本5 mL于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液標(biāo)本-20 ℃保存?zhèn)溆?尿蛋白檢測)。

1.2.3生化指標(biāo)及尿蛋白檢測 采用羅氏(上海)Cobas 8000全自動(dòng)生化分析儀檢測24 h尿蛋白水平，日立7600型全自動(dòng)生化分析儀檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。購買儀器配套成品試劑盒，檢測室的室內(nèi)溫度、濕度、操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4血清miR-21、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平檢測 先進(jìn)行外周血中總RNA的提取，按照miRNA 提取分離試劑盒操作說明書進(jìn)行；采用紫外分光光度計(jì)檢測RNA樣品的濃度和純度，比值在1.8～2.0者可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；再將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)操作說明書進(jìn)行；最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增，嚴(yán)格按照GoTaqR qPCR Master Mix試劑盒操作說明書進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)置 3 個(gè)平行重復(fù)，內(nèi)參為管家基因U6。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄Ct值，使用 2-ΔΔCt公式對(duì)miRNA進(jìn)行定量，計(jì)算血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平。qPCR檢測引物序列如下，miR-21上游引物:5′-TCG GCG GTA GCT TAT CAG ACT GA-3′;miR-21下游引物:5′-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3′。miR-125b上游引物:5′-TCC CTG AGA CCC TAA CTT GT-3′;miR-125b下游引物:5′-ACA AGT TAG GGT CTC AGG GA-3′。U6上游引物:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′;U6下游引物:5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

2 結(jié) 果

2.1一般資料比較 3組年齡和孕周比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；輕度組、重度組子癇前期患者收縮壓、舒張壓均較對(duì)照組明顯升高，新生兒體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)。重度組子癇前期患者收縮壓、舒張壓明顯高于輕度組(P<0.05)，新生兒體質(zhì)量明顯低于輕度組(P<0.05)。見表1。

表1 3組孕婦的一般資料比較

2.2血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平比較 3組血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間比較顯示，輕度組子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而重度組子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A表示miR-21的相對(duì)表達(dá)水平在3組間的比較；B表示miR-125b相對(duì)表達(dá)水平在3組間的比較。

2.3血清miR-21、miR-125b與子癇前期相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 孕婦血清miR-21、miR-125b與收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、Scr、BUN呈正相關(guān)(P<0.05)，與新生兒體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.4血清miR-21、miR-125b對(duì)子癇前期的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，血清miR-21單獨(dú)檢測診斷子癇前期的曲線下面積(AUC)為0.836(95%CI：0.762～0.910)，最佳臨界值為1.137時(shí)，靈敏度為74.1%，特異度為72.6%；miR-125b單獨(dú)檢測診斷子癇前期的AUC為0.801(95%CI：0.722～0.880)，最佳臨界值為1.408時(shí)，靈敏度為70.0%，特異度為73.5%。依據(jù)血清miR-21、miR-125b單獨(dú)診斷的最佳臨界值對(duì)子癇前期進(jìn)行聯(lián)合檢測，聯(lián)合檢測診斷子癇前期的AUC為0.914(95%CI：0.865～0.964)，靈敏度為88.7%，特異度為68.3%。見圖2。

圖2 血清miR-21、miR-125b單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)子癇前期診斷的ROC曲線分析

3 討 論

子癇前期是臨床常見疾病，主要表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓并伴有反復(fù)蛋白尿，可致孕婦腎臟、肝臟或神經(jīng)等系統(tǒng)受損，亦可抑制胎兒生長，嚴(yán)重影響孕婦、胎兒的健康[6-7]。子癇前期發(fā)病機(jī)制尚不十分明晰，除環(huán)境、心理等因素外，母體抵抗力、胎盤及胎兒生長不佳也可影響其發(fā)病[8]。研究認(rèn)為，多種原因造成胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能缺陷而出現(xiàn)細(xì)胞缺血、缺氧，激活細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)、炎癥應(yīng)答等，應(yīng)激因子、炎癥因子進(jìn)入血液循環(huán)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，進(jìn)而造成子癇前期的發(fā)生、進(jìn)展[9-10]。因此，早期對(duì)子癇前期進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷，干預(yù)其病理、生理進(jìn)展，對(duì)預(yù)防嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥、延長孕周、保護(hù)母嬰健康均有積極意義。疾病診斷的生物標(biāo)志物應(yīng)具備較好的預(yù)測價(jià)值，較高的特異度和靈敏度，并在體內(nèi)穩(wěn)定存在，有較長檢測窗口期。本研究結(jié)果顯示，血清miR-21、miR-125b在子癇前期患者中表達(dá)存在差異，并且與子癇前期嚴(yán)重程度有一定關(guān)系，說明血清miR-21、miR-125b可能作為子癇前期無創(chuàng)診斷標(biāo)志物。

miRNA在人體內(nèi)廣泛存在，其自身并不編碼蛋白質(zhì)，而是通過與特定靶基因結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等病理、生理過程中發(fā)揮重要作用。此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅通過自身表達(dá)變化在疾病發(fā)生、進(jìn)展過程中發(fā)揮抑制或促進(jìn)作用，而且在血液循環(huán)中也存在差異性表達(dá)[3,11]。血清核酸物質(zhì)檢測被認(rèn)為是無創(chuàng)診斷未來的發(fā)展方向，在疾病發(fā)生早期DNA、RNA等核酸物質(zhì)釋放入血，并可長期、穩(wěn)定存在于血液循環(huán)中，通過對(duì)它們的檢測能夠較早地對(duì)疾病進(jìn)行診斷、預(yù)判而讓患者獲益[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者血清miR-21、miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平均高于健康妊娠孕婦，且組間比較顯示，重度組子癇前期患者血清miR-21、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平要明顯高于輕度組。有研究發(fā)現(xiàn)，在子癇前期患者胎盤組織中血清miR-21、miR-125b表達(dá)明顯增加[6,13]，提示二者可能參與子癇前期的發(fā)生。當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞缺血、缺氧而致血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)炎癥應(yīng)答時(shí)，血清miR-21可加快B細(xì)胞活化而促進(jìn)細(xì)胞因子、趨化因子分泌，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥應(yīng)答，加重胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[14]。血清miR-125b參與子癇前期發(fā)生的可能機(jī)制為血清miR-125b靶向作用于鞘氨醇-1-磷酸受體基因，再通過復(fù)雜信號(hào)通路誘導(dǎo)白細(xì)胞介素8的表達(dá)，導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)的增強(qiáng)[15]。此外，血清miR-125b還可能通過鉀離子通道調(diào)控蛋白KCNA1來抑制人類滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，造成滋養(yǎng)細(xì)胞功能缺陷，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生[16]。

收縮壓、舒張壓升高是子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，并且與疾病預(yù)后密切相關(guān)。本研究中，一般資料比較結(jié)果顯示，子癇前期患者收縮壓、舒張壓較健康妊娠孕婦明顯升高，新生兒體質(zhì)量明顯下降，并且重度子癇前期患者更為明顯，這與多數(shù)子癇前期研究結(jié)果相符[6-9]，提示本研究納入病例無明顯偏差。由于小血管痙攣而致血壓升高、灌注不足，子癇前期患者多存在不同程度的腎臟受損。本研究進(jìn)一步分析患者血清miR-21、miR-125b與腎功能指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，血清miR-21、miR-125b與24 h蛋白尿、Scr、BUN呈正相關(guān)(P<0.05)，提示miR-21、miR-125b可能與子癇前期疾病進(jìn)展存在相關(guān)性，尤其是對(duì)子癇前期合并腎損傷具有一定預(yù)測價(jià)值。子癇前期可抑制胎兒宮內(nèi)生長，并且隨著病程、疾病嚴(yán)重程度增加胎兒受抑制更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-21、miR-125b與胎兒體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，提示血清miR-21、miR-125b對(duì)子癇前期患者圍產(chǎn)兒結(jié)局可進(jìn)行預(yù)判。

本研究ROC曲線結(jié)果顯示，血清miR-21、miR-125b對(duì)子癇前期具有單獨(dú)診斷價(jià)值，而將二者聯(lián)合檢測可增加診斷效能?？扇苄匝軆?nèi)皮生長因子受體-1與胎盤生長因子比值(sFlt-1/PlGF)是目前臨床常用子癇前期診斷指標(biāo)，但是PlGF隨著孕周增加而增加，在30周左右才能達(dá)到峰值；此外，子宮循環(huán)發(fā)生在妊娠10周左右，而PlGF失衡多在孕晚期，因此，sFlt-1/PlGF對(duì)子癇前期早期診斷價(jià)值有限[17]。miRNA作為終端蛋白表達(dá)的調(diào)控物質(zhì)，在疾病存在蛋白組學(xué)改變之前即可出現(xiàn)變化，并且進(jìn)入血液循環(huán)后可穩(wěn)定存在，是較好的子癇前期診斷標(biāo)志物。