G6PD基因c.592C>T和c.95A>G遺傳多態(tài)性與其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究

仇雯麗，丁科，董明右，凌永嫦，，石鳳，滕元姬，4，何麗橋，，王俊利，5，李妹燕

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，廣西 百色 533000；4. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 百色 533000；5. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 百色 533000)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥又稱蠶豆病，是最常見(jiàn)的一種遺傳性酶缺陷病，主要臨床表現(xiàn)為溶血性貧血、高膽紅素血癥。G6PD缺乏癥在瘧疾流行的地區(qū)廣泛分布，盡管非洲地區(qū)患病率高，但高人口密度使亞洲成為此疾病發(fā)病重心，并且患有此疾病的亞洲人群發(fā)生溶血的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)最高[1]。我國(guó)兩廣及云貴地區(qū)為高發(fā)地區(qū)，其中廣西地區(qū)人群攜帶率約為7.4%，男性發(fā)病率明顯高于女性[2]。成熟的紅細(xì)胞內(nèi)無(wú)線粒體，磷酸戊糖途徑是紅細(xì)胞內(nèi)唯一的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)來(lái)源，G6PD是細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵限速酶，對(duì)保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化損傷具有重要作用。G6PD酶表達(dá)水平較低時(shí)，患者會(huì)出現(xiàn)黃疸和急性溶血性貧血，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全[3]。G6PD的基因突變有著明顯的地域或群體特異性[1-2，4]，其中，我國(guó)廣西地區(qū)人群常見(jiàn)的基因突變類型主要為c.1376G>T、c.1388G>A、c.95A>G[5]。俸詩(shī)瀚等[5]研究了c.95A>G位點(diǎn)突變率高，尚未進(jìn)一步研究該位點(diǎn)的基因多態(tài)性，此外，c.592C>T位點(diǎn)突變僅見(jiàn)于廣東、廣西、山東和浙江等沿海地區(qū)[6]。因此，本研究將分析廣西地區(qū)G6PD基因相關(guān)位點(diǎn)c.592C>T和c.95A>G多態(tài)性與G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)篩查提供更有力的理論指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 通過(guò)病例對(duì)照研究，收集2017～2019年在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的G6PD缺乏癥患者及健康體檢者全血標(biāo)本(n=712)。G6PD缺乏癥患者為病例組(n=417)，女性156例，男性261例，平均年齡(35.06±22.33)歲。健康體檢者為對(duì)照組(n=295)，女性197例，男性 98例，平均年齡(36.11±18.48)歲。該研究經(jīng)過(guò)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)，且已獲得研究對(duì)象的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 G6PD活性測(cè)定及基因組 DNA 的提取和保存 收集研究對(duì)象抗凝血2 ml，使用日立全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)7600)檢測(cè)G6PD酶活性。使用上海執(zhí)誠(chéng)生物科技有限公司生產(chǎn)的貨號(hào)為GP8507的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測(cè)定試劑盒(速率法)檢測(cè)G6PD活性，并使用DNA提取試劑盒(深圳亞能生物科技有限公司)提取全血基因組DNA，于-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2 SNPscanTM多重SNP分型檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用上海天昊生物科技有限公司的SNPscanTM多重SNP分型試劑盒對(duì)c.592C>T和c.95A>G進(jìn)行分型。操作步驟為：①每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)3條探針，2條5′端鑒別探針和1條3′端探針，見(jiàn)表1；②將高溫處理后的短片段基因組DNA與探針混合物變性復(fù)性；③加入連接酶反應(yīng)體系；④利用帶熒光標(biāo)記的通用引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；⑤分析確定不同位點(diǎn)的基因型；⑥多重位點(diǎn)分型的實(shí)現(xiàn)：通過(guò)改變位點(diǎn)鑒別連接序列的長(zhǎng)度和加接連接反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)檢測(cè)，并且通過(guò)改變探針中通用引物序列，采用PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而進(jìn)一步增加檢測(cè)位點(diǎn)的數(shù)目。

表1 G6PD基因c.592C>T和c.95A>G位點(diǎn)PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)Logistic回歸計(jì)算兩位點(diǎn)基因型和等位基因分布差異，并且經(jīng)過(guò)性別、年齡、民族校正計(jì)算P值和OR值，G6PD病例組和對(duì)照組的臨床特征分布通過(guò)四格表χ2檢驗(yàn)分析。采用SHEsis在線軟件進(jìn)行兩位點(diǎn)的單倍型分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征分布 病例組和對(duì)照組在年齡分布上，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組性別差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，男性G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于女性(P<0.001)。民族在兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 G6PD病例組和對(duì)照組的臨床特征分布

2.2 G6PD基因SNP基因型和等位基因頻率比較 c.592C>T的基因型和等位基因與G6PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)，并且該位點(diǎn)的顯性模型和隱性模型與其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也不具有相關(guān)性。但是c.95A>G位點(diǎn)的基因型AG(Pa=0.001，OR=2.833，95%CI：1.459～5.370)和GG(Pa=0.005，OR=17.109，95%CI：2.313～126.547)與G6PD缺乏癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，是該疾病的致病因素。c.95A>G位點(diǎn)的顯性模型和隱性模型及其等位基因G在G6PD缺乏癥病例組和對(duì)照組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pa<0.05且OR>1)，見(jiàn)表3。結(jié)果表明，c.95A>G位點(diǎn)的顯性模型和隱性模型及等位基因G與G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，且是該疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素。

2.3 c.592C>T和c.95A>G與性別的相互作用對(duì)G6PD缺乏癥的影響 通過(guò)進(jìn)一步分析c.592C>T和c.95A>G兩位點(diǎn)與性別的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)男性攜帶c.592C>T位點(diǎn)的CC基因型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(Pa<0.001，OR=3.361，95%CI：2.451～4.608)。與攜帶c.95A>G位點(diǎn)AA基因型的女性相比，攜帶AG基因型的女性和攜帶AA和GG基因型的男性G6PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高(均有Pa<0.05且OR>1)，見(jiàn)表4。

表3 G6PD SNP基因型和等位基因在病例組與對(duì)照組的比較

表4 c.592C>T和c.95A>G與性別對(duì)G6PD缺乏癥的影響

2.4 G6PD基因及其多態(tài)性與G6PD表達(dá)水平的相關(guān)性 用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測(cè)G6PD酶在病例組和對(duì)照組表達(dá)水平的差異，并且比較c.592C>T和c.95A>G不同基因型之間G6PD酶表達(dá)的水平。研究結(jié)果如圖1所示：對(duì)照組G6PD酶表達(dá)水平高于病例組，兩組之間G6PD酶表達(dá)水平有差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見(jiàn)圖1A)，說(shuō)明G6PD缺乏癥發(fā)病與其酶表達(dá)含量降低有關(guān)。病例組中，c.592C>T位點(diǎn)的三個(gè)基因型CC、CT和TT之間酶表達(dá)水平?jīng)]有差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，見(jiàn)圖1B)。然而，G6PD酶表達(dá)水平在c.95A>G位點(diǎn)AA基因型和GG基因型、AG基因型和GG基因型中表達(dá)有差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，見(jiàn)圖1C)。圖1C表明，攜帶AA和AG基因型的患者G6PD酶表達(dá)活性較高。

注：A：表示病例組和對(duì)照組G6PD表達(dá)水平；B：c.592C>T位點(diǎn)不同基因型G6PD表達(dá)水平；C：c.95A>G位點(diǎn)不同基因型G6PD表達(dá)水平。

2.5 G6PD SNPs單倍型分析 將G6PD基因的兩個(gè)位點(diǎn)c.592C>T和c.95A>G通過(guò)在線SHEsis軟件進(jìn)行單倍型分析。分析結(jié)果見(jiàn)表5，c.592C>T和c.95A>G位點(diǎn)有三種單倍型組合，包括CA、CG和TA。CA單倍型在G6PD病例組和正常組分別占86.21%和97.46%。該單倍型在病例組和正常組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，OR=0.171，95%CI：0.098～0.296)，CA單倍型可能是G6PD缺乏癥的保護(hù)因素。CG單倍型在G6PD病例組和正常組分別占13.19%和2.54%，CG單倍型在兩組中差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，OR=5.865，95%CI：3.382～10.170)，提示攜帶CG單倍型的人患G6PD缺乏癥的風(fēng)險(xiǎn)增加，該單倍型是G6PD缺乏癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。

表5 G6PD SNPs單倍型分析及與該疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

3 討論

G6PD缺乏癥屬于遺傳性酶缺陷病，主要是由于G6PD基因發(fā)生變異所引起。從1990年到2013年，全世界約4億人患有G6PD缺乏癥，平均每年約4100人死亡[7]。G6PD缺乏癥大多是無(wú)癥狀的，然而G6PD缺乏癥患者暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境中，如接觸蠶豆、感染或某些藥物時(shí)極易產(chǎn)生溶血反應(yīng)[8]。G6PD基因位于 Xq28 染色體上，該染色體由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，編碼515個(gè)氨基酸。男性只攜帶一條X染色體，女性攜帶兩條X染色體，因此男性發(fā)病率大于女性。在中國(guó)，G6PD 缺乏癥主要發(fā)生在華南地區(qū)，呈“南高北低”的分布特點(diǎn)[6]，其中廣西地區(qū)發(fā)病率為8.02%[9]，因此，研究廣西人群G6PD 基因多態(tài)性對(duì)于本地區(qū)居民健康至關(guān)重要。

G6PD缺乏癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與地域、性別存在相關(guān)性，而且與年齡無(wú)關(guān)。在該研究人群中，我們發(fā)現(xiàn)，壯族人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非壯族人群，這與Liu ZD等[6]研究結(jié)果相一致，而男性發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于女性，這與G6PD缺乏癥主要是由于位于X染色體的基因突變導(dǎo)致G6PD酶表達(dá)活性降低有關(guān)相一致[10]。進(jìn)一步研究性別與c.592C>T和c.95A>G相互作用對(duì)G6PD缺乏癥的影響，發(fā)現(xiàn)與攜帶c.95A>G位點(diǎn)AA基因型的女性相比，女性攜帶AG基因型和男性攜帶AA和GG基因型G6PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。本研究通過(guò)分析G6PD基因相關(guān)位點(diǎn)c.592C>T和c.95A>G多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，在417例病例組中c.592C>T位點(diǎn)突變3例，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，c.592C>T位點(diǎn)突變與G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)，與譚建強(qiáng)等[11]研究發(fā)現(xiàn)301例突變基因c.592C>T突變僅1例基本吻合。其次，c.95A>G突變是廣西常見(jiàn)的突變類型之一[11-12]，本研究發(fā)現(xiàn)，c.95A>G位點(diǎn)的基因型AG和GG與G6PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，c.95A>G位點(diǎn)的顯性模型、隱性模型及等位基因G與G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。病例組G6PD酶表達(dá)活性明顯低于正常對(duì)照組，而且c.95A>G位點(diǎn)AA和AG基因型酶活性較高。利用在線SHEsis軟件將兩個(gè)位點(diǎn)c.592C>T和c.95A>G進(jìn)行單倍型分析，分析結(jié)果表明CA單倍型可能是G6PD缺乏癥的保護(hù)因素，CG單倍型使G6PD缺乏癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。

通過(guò)本研究，我們發(fā)現(xiàn)c.95A>G遺傳多態(tài)性與G6PD缺乏癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，為G6PD缺乏癥提供了相關(guān)遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)。雖然目前研究已經(jīng)證明基因突變可以導(dǎo)致G6PD缺乏癥，但是對(duì)其相關(guān)遺傳機(jī)制我們會(huì)再進(jìn)一步深入研究。