漿水發酵中的優勢乳酸菌分離鑒定

胡瑩瑩　趙麗　史力學　李全合

摘要：利用VITEK 2compact全自動微生物鑒定系統對漿水發酵過程中乳酸菌種類及數量進行鑒定，結果表明，發酵過程中優勢乳酸菌有4株乳酸菌菌株和2株酵母菌菌株。4株乳酸菌菌株分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發酵乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），其中優勢菌群為發酵乳桿菌和短乳桿菌;2株酵母菌菌株分別為平常假絲酵母（Candida inconspicua）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）。漿水發酵中的優勢乳酸菌為發酵乳桿菌和短乳桿菌。漿水發酵至第3～4 天時，植物乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，發酵乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，短乳桿菌為3.2×106～6.5×107 CFU/mL，乳酸片球菌為4.6×105～2.5×106 CFU/mL，此時漿水風味最佳。

關鍵詞：漿水;發酵優勢菌群;乳酸菌;酵母菌;分離鑒定

中圖分類號：TS255.3 ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ?文章編號：1001-1463（2021）04-0043-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.04.011

Isolation and Identification of Dominant Lactic Acid Bacteria in Fermented Pickle Juice

HU Yingying， ZHAO Li， SHI Lixue， LI Quanhe

（Tianshui Food Inspection and Testing Center， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract：VITEK 2Compact automatic microbial identification system was used to identify the species and quantity of lactic acid bacteria in the pickle juice fermentation process. The results showed that there were 4 strains of lactic acid bacteria and 2 strains of yeast in the fermentation process. The four Lactobacillus strains were Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici， respectively， and the dominant bacteria were Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis. Two strains of yeast strains respectively Candida inconspicua and Candida rugosa. The dominant lactic acid bacteria in the fermentation of pickle juice were Lactobacillus fermentum and Lactobacillus brevis. At the 3rd to 4th day of fermentation， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici were 1.2×107～1.6 ×107 CFU/mL， 1.2×107～1.6 ×107 CFU/mL， 3.2×106～6.5×107 CFU/mL and 4.6×105～2.5×106 CFU/mL， respectively， indicating the best flavor of the pickle juice.

Key words：Pickle juice;Dominant population;Lactic acid bacteria;Yeast;Isolation and identification

發酵蔬菜是以各種蔬菜為原料，利用有益微生物的活動并且控制其一定的生長條件，對蔬菜進行發酵加工后制成的食品。發酵蔬菜主要有泡菜、酸菜、醬菜和腌菜等[1 - 2 ]。漿水是甘肅、陜西等我國西北地區民間廣泛流傳的一種傳統發酵食品，一般以芹菜為原料，加入面湯和老漿水（俗稱“引子”）發酵而成。口味酸醇、清香，且其漿水營養豐富，具有調中引氣、開胃止渴、解煩去睡、調理臟腑、利小便和降血壓等功效[3 ]。傳統漿水發酵微生物菌系復雜，主要包括枯草芽孢桿菌、醋酸菌 、乳酸菌、酵母菌、霉菌等，其中優勢菌群為乳酸菌和酵母菌，且乳酸菌多為厭氧或兼性厭氧菌株[3 - 6 ]。我們按照已有傳統工藝制作芹菜漿水，研究了漿水發酵中乳酸菌種類及其優勢菌群、變化規律，以期對漿水工業化生產提供科學依據。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 供試材料

供試新鮮漿水、芹菜、面粉均為市售。

1.2 ? 儀器與設備

EX30生物顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），Bio II Advance二級生物安全柜（西班牙泰事達公司），XW-80A旋渦混合器（上海精科實業股份有限公司），MJ-350B霉菌培養箱、SPX-350B生化培養箱（上海瑯玕實驗設備有限公司），MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫療器械株式會社），MGC厭氧培養盒（日本三菱化學株式會社中國有限公司），VITEK 2compact全自動微生物鑒定系統（法國生物梅里埃股份有限公司）。

1.3 ? 培養基

分離培養基為MRS培養基、MC培養基、孟加拉紅培養基，鑒定培養基為蛋白胨水培養基、葡萄糖蛋白胨水培養基、明膠基礎培養基、V-P實驗培養基、檸檬酸鐵銨半固體培養基、含5%羊血的胰酶大豆瓊脂培養基、含5%羊血的哥倫比亞血瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基。均購自北京陸橋生物技術有限責任公司。

1.4 ? 試驗方法

1.4.1 ? ?漿水制作工藝 ? ?采用傳統工藝。將芹菜洗凈切成寸段，沸水熱燙3 min撈出，瀝水備用。用面粉、水按質量比1∶200煮制面湯，芹菜、面湯按質量比1∶4入缸，溫度降至30 ℃時按4%含量加入上述原漿水為引子，攪勻后進行發酵[7 ]。

1.4.2 ? ?芹菜漿水發酵過程中優勢菌群的變化

漿水中優勢菌有乳酸菌、酵母菌。采用平板計數法，在發酵當天起每天同時采樣，乳酸菌按GB4789.35 — 2016方法[8 ]、酵母菌按GB4789.15 — 2016方法測定其菌數[9 ]，記錄培養皿中各類菌落數目、優勢菌等。具體培養條件詳見表1。

1.4.3 ? ?發酵過程中乳酸菌群的分離鑒定 ? ?①分離純化。在 MRS 培養基、MC培養基、孟加拉紅培養基上，用接種環挑取生長形態不同，具有鈣圈的優勢菌落于無菌生理鹽水中，濃度稀釋到×10-5、×10-7。涂布接種于分離培養基平板上，37 ℃培養 72 h 后挑取菌落豐厚，且占生長優勢的單菌落反復純化，從不同發酵時期的漿水中分離出不同形態菌落，進行純化培養。將所獲菌株編號并保存備用。②菌株初步鑒定。鏡檢菌落形態和菌體形態。③生理生化鑒定。將上述菌株連續活化2次，通過革蘭染色鏡檢，KOH試驗、過氧化氫酶試驗、H2S 試驗、V-P試驗、硝酸鹽、明膠液化、吲哚試驗、產葡聚糖試驗、碳水化合物發酵等試驗進行菌種鑒定[6， 8 ]。④儀器生化鑒定。用接種環挑取適量培養18～24 h的菌苔至3 mL 0.45%NaCl溶液中， 配成0.5～0.65 Mac單位的菌懸液，選用適合的VITEK鑒定卡，將卡上彎管插入配制好的菌懸液中， 置于VITEK 2compact全自動微生物鑒定系統進行儀器自動讀卡鑒定。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 菌株分離和純化

經幾代純化獲得6株菌株，其中由MRS上分得3株，分別記為L1、L2、L3;由MC上分得1株記為L4，由孟加拉紅上分得2株，分別記為Y1、Y2。

2.2 ? 菌株初步鑒定

分別對L1、L2、L3、L4、Y1、Y2等菌株在 MRS培養基 、MC培養基和孟加拉紅培養基上的菌落和菌體形態特征進行觀察的結果見表2、圖1。由表2和圖1看出，菌株Y1、Y2菌體為革蘭染色藍色，菌體較大，棒狀或橢圓狀，有芽殖等，初步判定為酵母菌，菌株L1、L2、L3、L4需進一步鑒定。

2.3 ? 生理生化鑒定

生理生化鑒定的結果（表3、表4）表明，菌株L1、L2、L3、L4 的KOH、H2O2、V-P、吲哚試驗均表現為陰性，但對碳水化合物的利用不同，根據《伯杰細菌鑒定手冊》 （第八版）、《常見細菌系統鑒定手冊》及乳酸細菌分類鑒定及試驗方法[10 - 11 ]，將菌株 L1、L2、L3、L4初步鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發酵乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）;依據《酵母菌特性及鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》[12 - 13 ]，將分離菌株Y1、Y2初步鑒定為假絲酵母（Candida inconspicua、Candida inconspicua）。VITEK 2compact 微生物分析系統自動化程度高，較傳統生化鑒定試劑盒操作簡單，且耗時更短，快速高效，鑒定結果準確可靠。從表5可以看出，經VITEK 2compact 鑒定，菌株L1為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株L2為 發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株L3為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），菌株L4為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），菌株Y1為平常假絲酵母（Candida inconspicua），菌株Y2為皺褶假絲酵母（Candida rugosa），可見 VITEK 2compact 鑒定結果與生化鑒定結果基本吻合。

2.4 ? 漿水發酵過程中優勢乳酸菌群的變化

漿水發酵過程中優勢乳酸菌群生長變化情況見表6及圖2，酵母菌生長變化見圖3。由表6及圖2可見，漿水發酵過程中的優勢乳酸菌群菌株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）以第4天數量最多，為1.6×107 CFU/mL;第3天次之，為1.2×107 CFU/mL，其余時間為8.5×105～9.0×106 CFU/mL。發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）以第2天最多，為5.0×108 CFU/mL;第3天次之，為1.3×108 CFU/mL;其余時間為5.4×106～1.4×107 CFU/mL。短乳桿菌（Lactobacillus brevis）以第3天最多，為6.5×107 CFU/mL;第2天次之，為4.6×107 CFU/mL;其余時間為2.5×105～1.9×107 CFU/mL。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）以第4天最多，為2.5×106 CFU/mL;第3天次之，為4.6×105 CFU/mL;其余時間為1.5×102～4.6×105 CFU/mL。菌株Y1為平常假絲酵母（Candida inconspicua），菌株Y2為皺褶假絲酵母（Candida rugosa），二者均為假絲酵母，因此平常假絲酵母+皺褶假絲酵母以第6天、第7天最多，均為3.5×105 CFU/mL;第5天次之，為3.0×105 CFU/mL;其余時間為9.2×103～2.2×105 CFU/mL。可見，在漿水發酵初期（1～2 d）乳酸菌數量較少，產品沒有酸味，此時主要是需氧微生物枯草芽孢桿菌、醋酸菌、明串珠菌占優勢[6 ]。2 d后乳酸菌數量開始增加，隨著酸度的降低成為優勢菌群，活躍是在發酵中期（3～5 d），這與前人的研究基本一致[6 ]。此時發酵乳桿菌、希氏乳桿菌生長占優勢，在發酵第3天達到峰值;隨著發酵的進行，屬于同型乳酸發酵的植物乳桿菌開始占優勢并在第4天達到峰值。從計數上看，在乳酸菌活躍的整個發酵期，發酵乳桿菌和希氏乳桿菌在數量上占絕對優勢，乳酸片球菌在整個發酵過程中數量較少，不是優勢菌群;發酵后期（第6～10天）乳酸菌數量減少，活力下降。由圖3可知，漿水發酵過程中酵母菌數量呈先增加后降低的趨勢，發酵前中期酵母菌生長受抑制，隨著乳酸菌活力的下降，從4 d后開始迅速生長;在發酵中后期（第5～7天）占優勢，同時在第6～7天時酵母菌數量達到峰值。試驗過程中還發現，在發酵6 d后漿水開始有霉菌滋生，霉菌、酵母菌的數量逐漸增加，質量下降，風味不再酸香爽口。可見漿水在發酵第3～4天時達到最佳狀態，食用風味最佳。

3 ? 結論

經鑒定及測定，發現漿水中乳酸菌群有植物乳桿菌、發酵乳桿菌、短乳桿菌、乳酸片球菌等，其中優勢菌群為發酵乳桿菌和短乳桿菌，酵母菌群有平常假絲酵母+皺褶假絲酵母。漿水發酵過程中優勢乳酸菌群菌株植物乳桿菌以第4天最多，為1.6×107 CFU/mL;第3天次之，為1.2×107 CFU/mL，其余時間為8.5×105～9.0×106 CFU/mL。發酵乳桿菌以第2天最多，為5.0×108 CFU/mL;第3天次之，為1.3×108 CFU/mL，其余時間為5.4×106～1.4×107 CFU/mL。短乳桿菌以第3天最多，為6.5×107 CFU/mL;第2天次之，為4.6×107 CFU/mL，其余時間為2.5×105～1.9×107 CFU/mL。乳酸片球菌以第4天最多，為2.5×106 CFU/mL;第3天次之，為4.6×105 CFU/mL，其余時間為1.5×102～4.6×105 CFU/mL。菌株Y1為平常假絲酵母，菌株Y2為皺褶假絲酵母，二者均為假絲酵母，因此平常假絲酵母+皺褶假絲酵母以第6天、第7天最多，均為3.5×105 CFU/mL;第5天次之，為3.0×105 CFU/mL，其余時間為9.2×103～2.2×105 CFU/mL。漿水發酵至第3～4天時，植物乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，發酵乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，短乳桿菌為3.2×106～6.5×107 CFU/mL，乳酸片球菌為4.6×105～2.5×106 CFU/mL，食用風味最佳，可直接食用或真空貯藏待售。

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（本文責編：鄭立龍）

收稿日期：2021 - 01 - 25;修訂日期：2021 - 03 - 01

基金項目：天水市科技支撐計劃項目（2020-SHFZKJK-4676）。

作者簡介：胡瑩瑩（1986 — ），女，甘肅天水人，工程師，碩士，主要從事食品微生物檢測工作。Email：289579020@qq.com。