貓頭刺總黃酮提取工藝和含量測定研究*

孟憲琦，岳 鑫，王曉琴

內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110

貓頭刺又名鬼見愁、老虎爪子，為豆科棘豆屬貓頭刺（Oxytropis aciphyllaLedeb.）的全草，矮小半灌木，是蒙古高原荒漠化草原區的特征物種，生于海拔1000～3250 m的礫石質平原、薄層沙地、丘陵坡地及砂荒地上，分布于內蒙古、陜西、寧夏、甘肅、青海、新疆等省區［1］。莖葉搗碎煮汁可治膿瘡［2-3］。

棘豆屬植物全世界有300 多種，我國分布有150 多種。該屬植物化學成分類型多樣，包括黃酮類、皂苷類、生物堿、木脂素、酚酸類等［4-5］。許多植物具有顯著的藥理活性，在民間，尤其是在蒙藥和藏藥中有著悠久的使用歷史。棘豆屬植物的國內外研究較多，但關于這一荒漠草原建群植物貓頭刺的藥學研究國內外較罕見［6-7］。已有的研究表明黃酮類成分是棘豆屬藥用植物的主要活性成分［8-11］，本實驗通過鹽酸鎂粉顯色反應初步確定貓頭刺中含有黃酮類化合物，因此本研究首次對貓頭刺的總黃酮提取條件進行優選，并建立了紫外分光光度法測定其總黃酮含量的有效方法，期望為貓頭刺藥材進一步的研究和開發利用提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器AL-204 型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；UVmini-1280 型紫外可見分光光度計［島津儀器（蘇州）有限公司］；KQ-500E超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；SB-1300型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥材實驗用的4 批貓頭刺藥材均在內蒙古地區采集，陰干，經由內蒙古醫科大學渠弼教授鑒定為貓頭刺Oxytropis aciphyllaLedeb.的干燥全草，本研究建立含量測定方法和黃酮單因素實驗考察所用藥材均為4 號樣品。芹菜素標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20981）；三乙胺（天津市津東天正精細化學試劑廠，乙醇（天津市津東天正精細化學試劑廠）；甲醇（天津市津東天正精細化學試劑廠），以上試劑均為分析純；實驗用水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備取干燥至恒重的芹菜素對照品5 mg，精密稱定，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度。精密吸取0.5 mL 溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得50 μg/mL的芹菜素對照品溶液，貯藏于4℃冰箱備用。

2.2 供試品溶液的制備取干燥的貓頭刺藥材粉末（粉碎過4號篩）0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇25 mL，超聲提取40 min，搖勻，并過濾，取續濾液，即得。

2.3 三乙胺顯色法和測定波長的選擇取供試品溶液和對照品溶液各1 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇1 mL，加1%三乙胺溶液定容至刻度，以隨行試劑為空白對照，在200～800 nm波長范圍內進行掃描。結果表明對照品溶液與供試品溶液均在395 nm處有最大吸收，且干擾較小，故選擇395 nm作為測定波長，見圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線繪制 精密吸取芹菜素對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，按“2.3”項下的方法顯色后，在395 nm 處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，計算得到回歸方程Y=0.1139X-0.0119（r=0.9999）。芹菜素在2.5～15.0 μg/mL 范圍內與A值呈良好的線性關系，見圖2。

2.4.2 精密度試驗 取貓頭刺藥材粉末0.2 g，精密稱定，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測定吸光度A，重復操作6 次，結果測得供試品溶液吸光度A 的RSD 為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取貓頭刺藥材粉末0.2 g，精密稱定，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別于10、20、30、40、50、60、90 min 內按“2.3”項下的方法顯色，以顯色劑為空白，在395 nm處測定吸光度A，計算總黃酮平均含量的RSD為0.61%，表明樣品溶液在90 min內較穩定。

2.4.4 重復性試驗 取貓頭刺藥材粉末0.2 g，共6 份，精密稱定，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測定吸光度A，計算總黃酮平均含量的RSD為0.43%，表明本實驗采用的實驗方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率 試驗取已知含量的貓頭刺藥材粉末9 份（n=3），各約0.1 g，精密稱定，分別按已知總黃酮含量的80%、100%、120% 3 個水平加入芹菜素對照品溶液，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測定吸光度，計算平均回收率和RSD，結果見表1。

2.5 總黃酮提取條件單因素考察

2.5.1 提取溶劑 篩選取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，9 份，精密稱定，置于 50 mL 具塞錐形瓶中，分別以水、30%、50%、70%、100%的甲醇以及 30%、50%、70%、100%的乙醇各 25 mL 為提取溶劑，超聲30 min，過濾，取續濾液，按“2.3”項下的方法顯色，按“2.4.1”項下標準曲線計算總黃酮含量，依次為 1.890、1.206、1.216、1.703、1.435、1.407、1.905、1.853、0.982 mg/g。結果顯示以50%的乙醇為提取溶劑時，總黃酮提取率最高。在此基礎上，又篩選了三個水平乙醇濃度40%、50%、60%，結果顯示總黃酮含量依次為1.520、1.905、1.891 mg/g，因此選用50%乙醇溶液作為最佳提取溶劑，見圖3。

圖3 貓頭刺總黃酮提取溶劑的考察

2.5.2 提取方法的篩選 取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，2 份，精密稱定，置50 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 50%乙醇。1 份加熱回流提取30 min，搖勻，并過濾；另1 份超聲30 min，搖勻，并過濾。按“2.3”項下的方法顯色，按“2.4.1”項下標準曲線計算總黃酮含量。結果顯示回流提取效果略好，但兩種提取方法測得含量相差不大，考慮操作簡便快捷，所以確定提取方法為超聲提取。

2.5.3 浸泡時間的篩選 取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，4 份，精密稱定，加入 25 mL 50%乙醇后，浸泡時間分別為0、30、60、90 min，超聲提取30 min，搖勻，并過濾。按“2.3”項下的方法顯色，按“2.4.1”項下標準曲線計算總黃酮含量，依次為2.362、2.206、2.246、2.097 mg/g。結果顯示，樣品不浸泡時，總黃酮含量測定值最高，見圖4。

圖4 貓頭刺總黃酮浸泡時間的考察

2.5.4 提取時間的篩選 取貓頭刺藥材粉末約1.0 g，5 份，精密稱定，加入25 mL 50%乙醇后，分別超聲提取20、30、40、50、60 min，搖勻，并過濾。按“2.3”項下的方法顯色，按“2.4.1”項下標準曲線計算總黃酮平均含量，依次為2.030、1.977、2.104、2.036、1.998 mg/g，結果顯示，提取時間為40 min 時，樣品溶液總黃酮含量測定值最高，見圖5。

圖5 貓頭刺總黃酮超聲時間的考察

2.5.5 取樣量的篩選 分別取貓頭刺粉末約0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g，精密稱定，加入25 mL 的50%乙醇，超聲40 min，搖勻，并過濾。按“2.3”項下的方法顯色，按“2.4.1”項下標準曲線計算總黃酮平均含量，依次為2.446、2.260、1.917、2.050、2.104 mg/g，結果顯示當取樣量約為0.2 g 時，總黃酮含量測定值最高。

2.6 貓頭刺藥材總黃酮的含量測定取0.2 g不同產地的樣品各3 份，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在395 nm 處測定吸光度A，計算不同產地的貓頭刺總黃酮的平均含量，見表2。

表2 貓頭刺總黃酮的含量

3 討論

本實驗分別考察直接測定法、三氯化鋁顯色法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法和三乙胺顯色法，對于測定貓頭刺總黃酮的適用性，結果表明樣品溶液與對照品溶液經三乙胺顯色法顯色后均在395 nm處有最大吸收且吸收峰明顯，無雜峰干擾，因此本實驗將三乙胺顯色法確定為測定貓頭刺總黃酮含量的顯色方法。三乙胺顯色法的原理是當黃酮類化合物的羥基解離時，可以和三乙胺進行穩定的結合，從而進行檢測，此顯色方法的專屬性和準確性均較高［12-13］。

本實驗首次建立了采用紫外分光光度法測定貓頭刺總黃酮含量方法，操作方法簡便，結果準確度高，實驗方法重現性較高；并且初步探索了貓頭刺總黃酮的提取條件，對其提取條件進行優化。貓頭刺為季節性有毒植物，具有藥用價值，目前對其化學成分研究鮮見報道，期望本研究結果可以為其資源開發與利用提供可靠的參考。