大棗不同加工部位含糖量測定及脫糖大棗的研究思路*

馬寶珠 ，劉世軍 △，李 慧 ，劉 永

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室；3 陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心

大棗為鼠李科植物棗（Ziziphus jujubaMill.）的干燥成熟果實［1］，是我國傳統(tǒng)的滋補(bǔ)保健食品，其價值與功效毋庸置疑。眾所周知，大棗中含有較高的糖分，然而隨著糖尿病患者的增加，民眾對糖分的攝入有了警覺。大棗中含有的糖類主要有單糖、低聚糖、多糖。單糖主要為具有還原性的葡萄糖和果糖，比例大約為1∶1.2。葡萄糖是生命體內(nèi)新陳代謝不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，它氧化釋放出的熱量是人類生命活動所需能量的重要來源，但糖尿病患者卻應(yīng)盡可能少食或不食葡萄糖。那么，大棗不同加工部位中總糖、還原糖、低聚糖和多糖究竟是多少？本實驗將大棗分成浸膏、棗渣、粗多糖，分別測其含糖量，不僅可以準(zhǔn)確得出大棗不同加工部位中糖的含量，還可以為糖尿患者合理食用大棗提供一定的參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器101-3 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；N-1210B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；FW400AD 型高速萬能粉碎機(jī)（天津鑫博得儀器有限公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超生波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；島津UV-2600 紫外可見分光光度計；CPA225D 型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

1.2 試劑3，5-二硝基水楊酸（化學(xué)純，上海科豐實業(yè)有限公司），葡萄糖（天津市大茂化學(xué)試劑廠），酒石酸鉀鈉（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），硫酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司），苯酚（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），亞硫酸鈉（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），95%乙醇（安徽安特食品股份有限公司），以上均為分析純。

2 方法與結(jié)果

通過苯酚-硫酸法及3，5-二硝基水揚酸法對大棗浸膏、棗渣、粗多糖中的總糖和還原糖進(jìn)行測定［1-2］。大棗中的糖分為單糖、低聚糖和多糖。單糖的組成主要為果糖和葡萄糖，均為還原性糖。林勤保等［3］通過氣質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)，大棗單糖組分中果糖的相對含量為50.06%，葡萄糖的相對含量為 41.05%。安曉南［4］采用LC-MS 法對大棗中兩種含量較高的低聚糖進(jìn)行了初步定性分析，發(fā)現(xiàn)分別為蔗果三糖和蔗果四糖，均為功能性低聚糖，

而且沒有還原性。由于大棗低聚糖的成分研究尚不夠深入，只能根據(jù)現(xiàn)有的研究成果將大棗中的低聚糖歸為非還原性糖。大棗多糖也不具有還原性。故可以認(rèn)為大棗中還原性糖含量為單糖含量，總糖與還原糖含量之差在一定程度上反映了大棗多糖和低聚糖含量。

2.1 樣品的制備將大棗去核干燥處理，得4.132 kg大棗，在電磁爐上用12倍水煎煮3次，每次 3 h［5］，提取液過濾，備用。棗渣烘干，粉碎，即為樣品棗渣，共1070.07 g。將大棗水提液濃縮，放冷后用95%藥用乙醇沉淀，使含醇量達(dá)80%，凈置24 h，分離上清液，將沉淀烘干，粉碎，即為樣品粗多糖，共383.5 g；將上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，濃縮至無醇味，最后得到1640 mL（固含為1118.48 g）浸膏。

2.2 3，5-二硝基水楊酸液的制備A 液：稱取6.3 g 3，5-二硝基水楊酸（3.5-dinitrosalicylic acid，DNS），21.0 g 氫氧化鈉充分溶解于400 mL 煮沸后再放冷的純化水中。B 液：稱取182.0 g 酒石酸鉀鈉溶解于400 mL 煮沸過的溫水中，再加入5.0 g苯酚，5.0 g亞硫酸鈉，攪拌溶解。將A 液與冷卻后的B 液混合均勻，定容至1000 mL的棕色容量瓶中，于4℃冰箱中放置至少7天后使用［2］。

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖1.002 14 g，置于1000 mL 容量瓶中，加純化水溶解并定容，得1.002 14 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中放置備用。

2.4 6%苯酚溶液的制備精密稱取苯酚80 g 于100 mL 容量瓶中，加純化水溶解并定容，得80%苯酚溶液，于4℃冰箱備用。6%苯酚溶液由80%苯酚溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.5.1 總糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線 取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.1 mg/mL。精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL試管中，分別補(bǔ)純化水至2 mL，精密加入6%苯酚（現(xiàn)配）1.0 mL，搖勻后立刻加入5.0 mL 濃硫酸，常溫放置 30 min 后冷卻 5 min，于490 nm 處用紫外可見分光光度計測其吸光度值。以2 mL 純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對照。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

回歸方程：y=16.834x-0.0425，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9986。

圖1 總糖測定中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 還原糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 于25 mL 容量瓶中，補(bǔ)純化水至2 mL。搖勻后加入DNS 5.0 mL，沸水浴5 min 后，立即放入冰水中冷卻20 min，最后定容至刻度線，于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對照［6］。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

回歸方程：y=32.075x-0.0837，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9987。

圖2 還原糖測定中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 條件優(yōu)化

2.6.1 顯色條件 通過閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法顯色條件大都一致，而還原糖的顯色條件差異較大，故本實驗主要針對大棗中還原糖的最佳測定條件進(jìn)行考察。

2.6.2 最大吸收波長的選擇 取2 只25 mL 容量瓶，加入1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL純化水，再加入5 mL DNS溶液，搖勻后立即沸水浴3 min。取出，冰水浴20 min，再加純化水定容，搖勻，于450～600 nm波長范圍內(nèi)用紫外可見分光光度計進(jìn)行光譜掃描，測其吸光度。以2 mL 純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對照。掃描結(jié)果見圖3。由圖可知，波長為493 nm時有最大吸光度，故本實驗還原糖測定時選用的波長為493 nm。

圖3 光譜掃描圖

2.6.3 顯色劑用量的選擇 取7 只25 mL 容量瓶，分別加入1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL純化水，在分別依次加入2、3、4、5、6、7 mL 的DNS 溶液，搖勻后立即沸水浴3 min。取出，冰水浴20 min，再加純化水定容，搖勻，于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對照。結(jié)果見圖4。由圖可知，DNS用量為4～7 mL時，吸光度趨于穩(wěn)定，DNS用量為5 mL時，吸光度最大，故選擇加入顯色劑的用量為5 mL。

圖4 顯色劑用量對吸光度的影響

2.6.4 顯色反應(yīng)時間的選擇 取6 只25 mL 容量瓶，分別加入1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL純化水，再分別加入5 mLDNS溶液，搖勻后分別置于沸水浴中煮沸3、4、5、6、7 min顯色，取出，冰水浴20 min，再加純化水定容，搖勻，于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對照。結(jié)果見圖5。由圖可知，顯色反應(yīng)時間為5 min時測定的吸光度最大，故選擇顯色反應(yīng)時間為5 min。

圖5 顯色反應(yīng)時間對吸光度的影響

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度實驗 取7 只25 mL 容量瓶，分別精密移取0.5 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL 純化水，按照還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定吸光度值，測得吸光度分別為0.577、0.563、0.569、0.582、0.578、0.580，RSD=1.16%。結(jié)果表明，吸光度無明顯變化，說明該方法精密度良好。

2.7.2 穩(wěn)定性實驗 取2 只25 mL 容量瓶，分別精密移取0.5 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL 純化水，分別加入5 mL DNS 溶液，搖勻后置于沸水中水浴5 min 顯色，取出，冰水浴20 min，再加純化水定容，搖勻，于493 nm處用紫外可見分光光度計每隔5 min測一次吸光度，連續(xù)30 min考察穩(wěn)定性。以2 mL純化水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對照。測得吸光度分別為0.558、0.560、0.571、0.578、0.553、0.569，RSD=1.51%。結(jié)果表明，吸光度值30 min內(nèi)無明顯變化，說明此方法穩(wěn)定性良好。

2.7.3 還原糖加樣回收實驗 精密移取已知還原糖含量為0.375 mg/mL 的粗多糖溶液0.5 mL 為樣品，按還原糖量的80%、100%、120%精密加入0.5 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度值，計算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，還原糖平均加樣回收率為101.6%，RSD為4.6%，符合要求。見表1。

2.8 樣品測定取適量大棗浸膏、棗渣、粗多糖稀釋至合適的倍數(shù)，采用已建立的方法測定總糖和還原糖。目前大棗中低聚糖和多糖含量無法直接有效測定，總糖量與還原糖量在一定程度上反映了低聚糖和多糖含量。本實驗采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，采用DNS 法測定還原糖含量，兩者之差可以初步認(rèn)定為低聚糖和多糖含量。

干燥后的大棗果肉共4132 g，則此大棗的含糖量為52.14%，其中還原糖含量為36.90%，占總糖的70.78%；低聚糖和多糖含量為15.24%，占總糖含量的29.22%。大棗通過煎煮，水提液的含糖量占總含糖量的70.76%。在粗多糖中，低聚糖和多糖的收率為7.04%，純度為11.57%，所以使用95%乙醇醇沉大棗浸膏使含醇量達(dá)80%，僅一次分離提取多糖和低聚糖的效果并不理想，并且還有一部分多糖和低聚糖存在于棗渣中，并未煎煮出來。大棗浸膏、棗渣和粗多糖的含糖量測定見表2。

表1 還原糖加樣回收實驗

表2 大棗浸膏、棗渣和粗多糖的含糖量測定

3 討論

在大棗所含糖分中，還原糖（主要為葡萄糖和果糖）占總糖含量的70.78%。這也是糖尿病患者不可食用過多大棗的主要原因。然而大棗中的還原糖差不多二分之一為果糖。長期臨床觀察表明，果糖對控制糖尿病的病情有一定效果［7-8］。果糖廣泛存在于各種水果中，機(jī)體吸收后，由于果糖激酶的活性不依賴胰島素調(diào)控，可在無胰島素參與的情況下，直接轉(zhuǎn)化為糖原，故對血糖的影響小［9］。

低聚糖和多糖，這兩類糖對人體還是非常友好的，包括糖尿病患者。大棗中兩種含量較高的低聚糖均為功能性低聚糖，具有低熱量、抗齲齒、抗腫瘤、防治糖尿病、防止腹瀉和便秘等生理作用［10］。大棗多糖具有保肝、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、降血脂、調(diào)節(jié)血糖和提高免疫力等多種作用［11-12］。大棗中這兩類糖占總糖含量的29.22%，占大棗含量的15.24%。

將大棗中不同種類的糖進(jìn)行研究分析，有望開發(fā)出適合于糖尿病患者的脫糖大棗，滿足糖尿病人群食用大棗的需求。同時使大棗資源最大化利用，延長大棗產(chǎn)業(yè)鏈條，提高大棗附加值，為大棗資源的可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。