化瘀通陽方對潰瘍性結腸炎大鼠IL-23/JAK-STAT 信號通路的影響*

楊 潔，施麗婕

1 天津中醫藥大學研究生院，天津 301617；2 天津中醫藥大學第一附屬醫院

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腸道炎癥和腸黏膜損傷為主要病變特征的非特異性炎性腸病。目前研究發現腸道免疫失調在誘導UC發生發展的過程中發揮重要作用［1］。白細胞介素 23（interleukin-23，IL-23）作為一類由免疫細胞分泌的細胞因子，其可以通過激活非受體酪氨酸激酶（just another kinase，JAK）信號轉導蛋白及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號轉導途徑，產生致炎因子，促進或加重機體炎癥反應，諸多研究表明IL-23 在炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）和其他自身免疫相關疾病中具有強烈的治療靶向性［2］，近年來中醫藥在調控IL-23 表達治療疾病方面取得良好療效［3］。化瘀通陽方由薤白、五靈脂、蒲黃組成，該方具有通陽、散瘀、止血之功，能夠在宣通機體郁滯之衛陽的同時攜營氣行經絡達病所，衛主營從［4］，營衛同調，剛柔相得，進而增強機體御邪能力和免疫作用，促進自我修復。課題前期研究已經證實該方在UC 腸屏障方面可以改善腸道血液高凝狀態，降低腸黏膜通透性，促進黏膜愈合，恢復腸道功能。基于此本研究進一步從炎癥-免疫方面探討化瘀通陽方對UC 大鼠IL-23 水平及JAK-STAT信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇雄性8 周齡Wistar 健康大鼠32 只，體質量約（210±10）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK-（京）2016-0006。所有大鼠置于相同環境條件下適應性飼養7天，飼養溫度（24±1）℃，濕度45%±15%，自由飲水、進食。

1.2 藥物及儀器化瘀通陽方藥物組成：五靈脂10 g，薤白10 g，蒲黃10 g（上述藥物均由天津中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供）；美沙拉嗪灌腸液（莎爾福，德國Falk 藥廠，批號：17B16）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，美國MP 公司，批號：18008540530）；ELISA 檢測試劑盒（RayBiotech，批號：Q91Z84）；Bradford 法蛋白定量試劑盒（北京普利來基因技術有限公司，批號：P1510）；BSA 標準品（BBI life sciences，批號：B600036-0260）；四甲基乙二胺試劑（Diamond，批號：A100761-0025）；臺式高速離心機（Eppendrof）。

1.3 實驗方法在32 只大鼠中隨機選取8 只大鼠設為空白對照組，不加干預；剩余24 只大鼠設為模型復制組并采用5%葡聚糖硫酸鈉溶液（DSS）灌胃結合自由飲用，7天后隨機選取其中6只大鼠和空白對照組2 只大鼠采用頸椎脫臼法處死，剖取結腸組織并進行病理組織學檢查，觀察造模是否成功。造模成功后第2 天，將模型復制組18 只大鼠按隨機數字表法分為模型組、化瘀通陽組和美沙拉嗪組，每組6 只，未加干預的6 只大鼠為空白對照組。空白對照組和模型組大鼠均給予生理鹽水2 mL/只灌腸，化瘀通陽組和美沙拉嗪組分別予化瘀通陽方劑、美沙拉嗪灌腸液各2 mL/只灌腸，各組大鼠每天灌腸1 次，連續治療10 天。10天后將全部大鼠采用頸椎脫臼法處死，剖取其結腸組織留用。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分 觀察大鼠精神及活動狀態、飲食情況、大便性狀，利用鄰聯甲苯胺法對每組大鼠糞便進行便潛血檢測，并結合每日體質量變化作出DAI評分，評分標準見表1。

1.4.2 結腸長度變化及組織病理學檢查 測量比較各組大鼠結腸長度后將結腸組織剪成1～1.5 cm2大小、3～4 mm 厚的小塊用福爾馬林固定，常規包埋、切片，HE 染色，顯微鏡下觀察結腸組織病理情況。

表1 DAI評分標準

1.4.3 組織IL-23 含量的檢測 將大鼠結腸組織稱重后剪碎，置于玻璃勻漿器中，于干冰上充分研磨，離心提取上清液。使用ELISA 檢測試劑盒，嚴格按照說明書步驟對IL-23含量進行檢測。

1.4.4 組織 JAK1、TYK2、STAT1、STAT4 蛋白的表達 將大鼠結腸組織樣本進行勻漿、裂解，收集蛋白樣品加入緩沖液，熱浴5 min 以充分變性蛋白。待冷卻后上樣、電泳。60 V電壓下2 h轉膜，TBS室溫搖床清洗10 min，加入TBST稀釋的5%脫脂奶粉室溫搖床上封閉1 h。取出膜加入一抗，4℃過夜孵育。完成后放入TBST 中室溫搖床洗滌10 min/次×3 次，TBS 洗滌 10 min 后加入二抗孵育 1 h，洗膜同前。最后將膜置入化學發光液A+B 混合液中1 min 取出，在暗室中剪下與膜同樣大小的膠片，壓在暗盒中1 min，放在顯影液中顯影，出現明顯條帶后置于定影液中定影5 min，沖洗，晾干。利用凝膠圖像處理系統進行組織JAK1、TYK2、STAT1、STAT4蛋白的表達分析計算。

1.5 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件對實驗數據進行統計分析，符合正態性分布，計量資料用表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，不符合正態性分布，組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DAI 評分1）造模期間，空白對照組大鼠精神及活動狀態良好，正常飲食，體質量逐日增加；模型復制組大鼠則表現出精神萎靡，少飲少食，稀便、血便及肛周潰爛，體質量下降，造模期間死亡3 只。模型復制組大鼠DAI 評分與空白對照組比較明顯升高，造模第5 天疾病活動情況變化顯著，見圖1A。2）治療期間，模型組大鼠于第4天死亡1只，整體改善不明顯，仍有血便、稀便，體質量雖有增長，但與給藥組相比趨勢較緩；化瘀通陽組、美沙拉嗪組兩組大鼠精神及活動狀態均有明顯改善，飲食較前增多，大便逐漸恢復正常，體質量呈現明顯上升趨勢，DAI評分顯著下降，見圖1B。

圖1 造模期和治療期各組大鼠DAI評分變化趨勢

2.2 結腸長度大鼠腸管長度模型組為（11.63±0.48）cm，空白對照組為（16.00±1.26）cm；化瘀通陽組為（15.80±1.64）cm，美沙拉嗪組為（15.80±0.84）cm?；鐾柦M、美沙拉嗪組大鼠腸管短縮情況明顯改善，黏膜充血水腫不明顯，未見明顯潰瘍。且兩組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 結腸病理學觀察空白對照組大鼠腸管表面光滑完好，黏膜各層結構清晰，無炎細胞浸潤，黏膜無充血水腫及潰瘍形成；模型組腸管黏膜下層有大量炎細胞浸潤，杯狀細胞大面積丟失，隱窩結構紊亂，黏膜粗糙、充血水腫，潰瘍形成；化瘀通陽組和美沙拉嗪組腸管短縮情況明顯改善，鏡下可見少量杯狀細胞丟失，炎細胞浸潤僅限于黏膜層，黏膜充血水腫不明顯，未見明顯潰瘍。見圖2。

圖2 各組結腸病理學表現（HE×400）

2.4 實驗室指標模型組大鼠結腸組織中IL-23含量較空白對照組明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通陽組、美沙拉嗪組大鼠結腸組織中IL-23 含量明顯下降（P＜0.01），且兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，模型組大鼠結腸組織中JAK1、STAT1、STAT4 表達升高；與模型組比較，化瘀通陽組、美沙拉嗪組大鼠結腸組織中 JAK1、STAT1、STAT4 表達均下調，且兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）；各組間TYK2 表達無差異（P＞0.05）。見表2、圖3。

表2 各組大鼠IL-23、AK1、TYK2、STAT1、STAT4水平比較（）

表2 各組大鼠IL-23、AK1、TYK2、STAT1、STAT4水平比較（）

注：與空白對照組比較，*表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；與模型組比較，＃表示P＜0.01，※表示P＜0.05

組別空白對照組模型組化瘀通陽組美沙拉嗪組STAT4 0.381±0.165 1.586±0.762▲0.546±0.062※0.505±0.188※鼠數3 3 3 3 IL-23（μg/mL）186.250±80.030 1643.330±556.851*544.471±348.491#444.647±253.719#JAK1 0.418±0.224 2.396±0.616*0.895±0.051#0.898±0.601#TYK2 0.223±0.163 0.584±0.102 0.338±0.036 0.507±0.646 STAT1 0.522±0.172 1.630±0.166*0.599±0.137#0.516±0.178#

圖3 各組大鼠結腸組織中JAK1、TYK2、STAT1、STAT4含量

3 討論

JAK-STAT 信號通路在炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）炎性反應中起著重要作用，目前被認為是IBD 的潛在治療靶點。多種細胞因子均依賴于JAK-STAT 信號通路促發腸道炎癥反應，抑制該通路可能導致多種炎性細胞因子的下調［5］，從而減緩組織損傷，促使腸黏膜愈合。IL-23 是IL-12 異二聚體細胞因子家族的新成員，結構上與IL-12相似［6］，功能卻不盡相同，主要促進Th17細胞的最終分化，誘導IL-17A和干擾素 γ 產生［7］。IL-23 作為 JAK-STAT 信號通路的始動因子之一，與細胞膜上相應受體結合激活下游JAKs分子，隨后磷酸化相關STAT分子形成二聚體或多聚體等，隨著細胞核發生轉位，使STAT 磷酸化產物特異性結合于DNA 序列，從而調節下游靶基因的轉錄，影響相關細胞因子表達和蛋白質合成［8］。PARHAM 等［9］在對免疫細胞 IL-23 下游信號通路的研究中檢測到不同含量的STAT1、STAT3、STAT4 存在，說明IL-23 可以不同程度地激活STAT1、STAT3、STAT4 分子表達。研究表明潰瘍性結腸炎患者血漿及組織中IL-23 過表達，且與疾病病理分級有明顯相關性［10］，組織中STAT1、STAT4 含量增高［11-14］，提示 IL-23、STAT1、STAT4 均可能參與潰瘍性結腸炎的炎癥反應。

本研究通過對各組大鼠DAI 評分及結腸長度的比較，結合組織病理切片觀察，發現化瘀通陽組大鼠DAI 評分及腸管短縮情況均得到顯著改善，炎細胞浸潤減少，腸黏膜恢復至正常結構，說明化瘀通陽方可以通過控制炎癥反應，減輕組織損傷，恢復腸道功能。同時，研究發現模型組大鼠結腸組織中IL-23含量和JAK1、STAT1、STAT4蛋白表達明顯增高，化瘀通陽組可以降低組織IL-23 水平和 JAK1、STAT1、STAT4 蛋白過度表達，與空白對照組比較無明顯差異，提示IL-23 可能作為一種前炎癥因子通過活化JAK-STAT 信號途徑，產生其他炎性因子作用于結腸組織而發揮致炎作用，化瘀通陽方則能夠減少組織中IL-23 的含量，從而抑制JAK-STAT 信號通路過表達，減少其他致炎因子的產生，減輕組織炎癥損傷，達到治療UC的目的。

化瘀通陽方立足于UC 衛陽郁滯、氣滯血瘀的病機特點［15-16］，認為衛陽在機體防衛免疫方面具有不可忽視的重要作用。衛陽作為機體陽氣中的一部分，由于其性慓疾滑利，能快速應對邪氣而達病所，具有主動向病患集結的趨向性以抵御邪氣［4］，故認為衛陽在一定程度上參與機體的炎癥免疫調節。方中薤白辛溫，功在宣通衛陽，程書彪［16］利用Griess 法間接檢測小鼠巨噬細胞中炎性因子含量首次發現薤白皂苷類化合物20 有明顯抗炎活性，與五靈脂、蒲黃同用，還能夠改善機體因陽氣郁滯造成血瘀的病理變化，正所謂“營衛二氣人身并重，未可重衛輕營也”。