HPLC法測定正骨水中丹皮酚含量的不確定度分析

陳恒沖 馬彬峽 孫曉寧

1.遼寧省本溪市藥品檢驗所，遼寧本溪 117000；2.遼寧省本溪市衛(wèi)生學(xué)校，遼寧本溪 117000

測量不確定度是利用可獲得的信息，表征合理地賦予被測量量值分散性的非負(fù)參數(shù)[1]。通過評估不確定度，使檢驗結(jié)果由單一數(shù)值變?yōu)榭赡芊植嫉臄?shù)值范圍[2]，可有效提高檢驗結(jié)論的準(zhǔn)確性和科學(xué)性[3-6]，尤其在檢測結(jié)果為邊緣值時，對結(jié)果符合性的判定起到重要作用。《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2015 年版介紹了pH 值測定法、非水溶液滴定法等檢驗方法不確定度評定的實例[7]，說明測量結(jié)果不確定度評定與表示將在我國藥品檢驗領(lǐng)域全面應(yīng)用，對我國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)及檢測數(shù)據(jù)與國際接軌起到積極的推動作用[8-14]。

本研究根據(jù)《測量不確定度評定與表示 》[1]和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[15]中的有關(guān)規(guī)定，利用在實驗室資質(zhì)認(rèn)定過程中對檢測方法確認(rèn)研究的數(shù)據(jù)，對《中華人民共和國藥典》2015 年版一部正骨水含量測定的檢測結(jié)果不確定度進(jìn)行評定分析[16]，并討論采用方法確認(rèn)數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度評定的優(yōu)勢。

1 測定方法及不確定度來源分析

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（日本島津，2010AHT 型）；電子天平（德國 Sartorius，BT25S 型）；正骨水（廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，批號：1811362）；丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量：99.8%，批號：110708-201407）；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為一級純化水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Aglilent zorbax C18（150 mm×5 mm）；流動相：乙腈-水-三乙胺-磷酸 （28∶72∶0.1∶0.1）；檢測波長：274 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：對照品溶液與供試品溶液各10 μl。

1.3 測量流程及結(jié)果計算模型

HPLC 法測定正骨水中丹皮酚含量的測量流程見圖 1。

圖1 丹皮酚含量測定流程圖

根據(jù)分析過程，丹皮酚的含量可用下面公式計算：

C χ為供試品中丹皮酚的含量（mg/ml）；Aχ為供試品溶液的峰面積；Ar為對照品溶液的峰面積；mr為對照品的稱樣量（mg）；P為對照品的純度，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)的形式給出（%）；Dr為對照品溶液的稀釋倍數(shù)；Dχ為供試品溶液的稀釋倍數(shù)。

1.4 不確定度來源分析

從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析對HPLC 法測定正骨水中丹皮酚含量的測定結(jié)果有影響的因素，確定可能產(chǎn)生不確定度的所有來源，包括對照品稱量誤差和重復(fù)性，對照品溶液稀釋過程，供試品溶液稀釋過程，HPLC 進(jìn)樣和峰面積積分的重復(fù)性等。HPLC法測定正骨水中丹皮酚含量的測量不確定度因果關(guān)系見圖2。

圖2 HPLC 法測定正骨水中丹皮酚含量的測量不確定度來源

因為方法確認(rèn)試驗中重復(fù)性和回收率的研究考慮了不同體積測量裝置校準(zhǔn)的影響[15]，如果采用方法確認(rèn)數(shù)據(jù)來評估測量不確定度，可將上述因果關(guān)系圖重新調(diào)整成圖3。重復(fù)性試驗測定了6 份平行配制的供試品溶液，對其不確定度分析可以涵蓋供試品溶液配制和測定的重復(fù)性不確定度，但卻不能涵蓋對照品溶液配制的不確定度，所以本例量取對照品溶液（1）另外配制6 份對照品溶液進(jìn)行測定。通過回收率的測定及不確定度分析，可涵蓋由玻璃量器校準(zhǔn)、進(jìn)樣器容量誤差、溫度以及其他諸多因素帶來的不確定度。未被重復(fù)性及回收率的不確定度分析涵蓋的來源，如本研究中的對照品稱量、對照品純度，仍應(yīng)分別予以考察。

圖3 HPLC法測定正骨水中丹皮酚含量的測量不確定度來源調(diào)整圖

2 測量不確定度評定

2.1 不確定度分量的量化

2.1.1 重復(fù)性（I，A 類評定）

2.1.1.1 供試品溶液重復(fù)性（Ix） 依法配制6 份供試品溶液分別測定峰面積，試驗數(shù)據(jù)見表1。供試品溶液重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.1.1.2 對照品溶液重復(fù)性（Ir） 精密量取對照品溶液（1）2 ml，依法稀釋，平行配制6 份對照品溶液分別測定峰面積，試驗數(shù)據(jù)見表1。對照品溶液重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.1.2 回收率（Rec，A 類評定） 精密量取供試品溶液5 ml，對照品溶液（1）3.5 ml，置于同一25 ml量瓶中，稀釋至刻度。平行配制6 份依法測定，試驗數(shù)據(jù)見表1。回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 ：

2.1.3 對照品純度 丹皮酚對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，純度以99.8%計，但未提供其不確定度的信息，故本文不予評定。

表1 重復(fù)性及回收率試驗數(shù)據(jù)

2.1.4 對照品稱量（mr）

2.1.4.1 天平校準(zhǔn)的不確定度（B 類評定） 所用電子天平（d=0.01 mg），依據(jù)計量檢定結(jié)果，最大示值誤差為±0.04 mg，按矩形分布計算，取包含因子，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4.2 稱量重復(fù)性的不確定度（B 類評定） 依據(jù)計量檢定結(jié)果，重復(fù)性誤差為±0.01 mg，按矩形分布，取包含因子 k =，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4.3 分辨率的不確定度（B 類評定） 天平的可讀性為0.01 mg，按矩形分布，取包含因子 k =，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成以上天平稱量不確定度來源，單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因采用減量稱量，2 次讀數(shù)獨立不相關(guān)，對照品取樣量為15.02 mg，則其引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

實驗中測得丹皮酚含量為0.22 mg/ml，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3 擴展不確定度與報告

實驗結(jié)果一般用擴展不確定度表示，取包含因子 k=2（置信概率約95%），則含量測定結(jié)果的擴展不確定度為：

正骨水中丹皮酚的1 次含量測定結(jié)果可表示為（0.22±0.0018）mg/ml（k=2）。

2.4 各不確定度分量對比

對比各不確定度分量可以看出，回收率對不確定度的影響最大，其次為對照品稱量。見圖4。

圖4 測量不確定度的比較

3 討論

通過擴展不確定度與報告的結(jié)果可以看出，本實驗室依法測定正骨水中丹皮酚含量的不確定度較小，僅為測定結(jié)果的±0.8%，說明該測定方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，本實驗室出具的測定結(jié)果可信度較高。對比各不確定度分量可以看出，回收率對不確定度的影響最大，其次為對照品稱量。檢測過程中應(yīng)重點關(guān)注回收率各影響因素的控制，保證高效液相色譜儀、玻璃量器均在穩(wěn)定可控的范圍內(nèi)使用，對照品溶液與供試品溶液在溫度穩(wěn)定的環(huán)境中同時配制。同時，檢測人員應(yīng)根據(jù)天平的精度和量程范圍選擇適宜的天平，并注意在稱量過程中規(guī)范操作。

在藥品檢測過程中，通常使用的將計算公式作為測量模型劃分不確定度分量的方式，本例利用重復(fù)性、回收率等方法確認(rèn)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度評定，可同時覆蓋不同測定環(huán)節(jié)的檢測結(jié)果影響因素，簡化不確定度評定步驟，又可以包含供試品制備過程、基質(zhì)干擾等無法量化和尚未考慮到的影響因素。但不同的檢測品種及項目，測定過程會有區(qū)別，應(yīng)結(jié)合實際，全面考慮不確定度來源，合理設(shè)計方法確認(rèn)試驗。

本研究僅采用了1 次方法確認(rèn)的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度評定，樣本數(shù)量相對較少。如結(jié)合不同時間、不同分析人員的重復(fù)性試驗，即中間精密度的數(shù)據(jù)，以及多次回收率試驗的數(shù)據(jù)，可以不斷修正不確定度分量，更合理的評定不確定度。