慢性不可預見應激刺激對小鼠體重的動態變化和炎癥因子水平的影響

袁前發 徐志忠 王文強 朱敬敬 溫春燕 段海珍 閆曉娜 何 玨

1.廈門市仙岳醫院精神衛生研究室，福建廈門 361000；2.河南省新鄉市中心醫院康復科，河南新鄉 453000；3.廈門市海滄醫院急診科，福建廈門 361000；4.福建中醫藥大學研究生院，福建福州 350000

抑郁癥屬于精神類的一種常見疾病，世衛組織將其確定為世界第四大疾病，因其具有高復發率、高致殘率、高致死率等特征，因而其在全球范圍內是一個負擔性疾病[1-2]。抑郁癥發病機制的假說主要有四種：單胺類神經遞質假說[3-4]、神經營養假說[5-6]、垂體-下丘腦-腎上腺皮質軸紊亂假說[7]和細胞因子假說[8-9]。其中細胞因子假說認為抑郁癥是一種免疫紊亂性疾病，強調免疫系統在發生和發展過程中的作用，某些應激刺激引起免疫系統的激活，導致細胞因子異常分泌，進而從多個層面影響中樞神經系統[10]。而細胞因子又分為前炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子，但這兩種炎癥細胞因子的改變是否與抑郁癥的發生有必然聯系暫未有明確的研究報告。同時，抑郁癥模型的構建過程中大多會衡量動物體重的變化，但體重變化與抑郁癥的關系并不十分明確。因此，本實驗采用慢性不可預見應激刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）構建抑郁癥模型，在模型的構建過程中觀察小鼠體重的動態變化，并檢測血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin- 6，IL-6）和白介素10（interleukin-10，IL-10）水平來驗證是否與抑郁癥發生具有關聯性，最后從小鼠相關行為學實驗評價此模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與分組

1.1.1 藥品與試劑 TNF-α、IL-6 和IL-10 酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒，購于上海江萊生物科技有限公司，生產批號分別為JL10484、JL20268、JL18442。

1.1.2 儀器 全自動酶標儀購于美國 Bio-Rad 公司（生產型號：168-1130）。

1.1.3 實驗動物 實驗動物選用BALB/c 雄性小鼠，8 周齡，體重18 ～20g，由廈門大學實驗動物中心提供，其購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK（京）2016-0006，動物實驗獲得廈門大學實驗動物倫理委員會授權。小鼠飼養于濕度 40%～50%、溫度（24.0±1.0）℃的通氣籠系統中。

1.1.4 實驗分組 42 只無特定病原體級小鼠，適應性飼養3 d，小鼠禁食12 h 后按照體重隨機分為兩組，即對照組（7 只）和模型組（35 只）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠抑郁模型構建[11]對小鼠進行單籠孤養，并給予每天包括固定在塑料管內、鼠籠傾斜、不筑巢、擁擠環境、明暗顛倒、白噪聲，共6 種刺激方法，每日2 種，每種刺激出現1 次，同樣刺激方式不同時出現，按照隨機原則分布各個應激周期中。見表1。

1.2.2 體重動態監測 實驗動物每隔兩天監測一次體重，并通過以下計算公式計算其體重變化。體重變化=第n 天的體重－第1 天的體重（0 ＜n≤28）。

1.2.3 強迫游泳實驗 迫使小鼠在裝有 15 cm 水（水溫保持 22 ～23℃）的透明塑料圓筒中游泳6 min，記錄后4 min 內不動時間。不動的標準是垂直漂浮在水中，同時僅進行那些必要的動作以將頭保持在水上，實驗結束后，將小鼠移出并在加熱燈下加熱直到其身體干燥。

1.2.4 蔗糖偏好 實驗小鼠適應性習慣兩個飲水瓶3 d 后，將每只小鼠單獨分籠，每籠中放置兩個飲水瓶，一個為1%蔗糖瓶，另一個含水瓶，測量水和蔗糖溶液攝入量的體積，同時每天更換兩個瓶子的位置以減少實驗誤差。計算公式為蔗糖偏好= V蔗糖溶液/[V蔗糖溶液+ V水]×100%。

表1 CUMS模型不同程序刺激表

1.2.5 曠場實驗 小鼠放置在尺寸為 90 cm×90 cm×30 cm 的木箱（內部劃分為36 個大小相同的正方形）中5 min，用 ANY-maze 軟件記錄和分析小鼠在測試時間內穿越中間方格的次數。實驗完成后將小鼠取出，在木箱內噴灑10%的乙醇溶液清潔儀器，以消除其運動痕跡對后面測試的影響。

1.2.6 血清標本采集 采用眼眶取血，血液采集后常溫靜置2 h，采用3000 r/min 離心10 min，收集血清，置于-80℃低溫冰箱中保存至檢測。

1.2.7 TNF-α、IL-6 和IL-10 含量測定 用 ELISA試劑盒測定各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-10 含量，所有操作按試劑盒所附說明書檢測，根據 ELISA 標準曲線計算樣本中3 個指標的含量。

1.3 統計學處理

應用統計學軟件SPSS 20.0 對實驗數據進行統計學分析，實驗數據均以（）表示，統計結果以Origin Pro 8 作圖，組間兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠的體重動態變化比較

造模4 d 后，對照組和模型組小鼠體重開始出現差異，但差異無統計學意義（P＞0.05）。造模第4 ～24 天時，對照組和模型組小鼠體重差異進一步加大，但差異無統計學意義（P＞0.05）。造模第24 天后，模型組小鼠體重明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。小鼠體重變化見圖1。

圖 1 兩組小鼠的體重動態變化

2.2 兩組小鼠行為學實驗結果比較

小鼠行為學實驗結果見圖2。造模28 d 后，模型組小鼠在強迫游泳實驗中不動時間顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2A；糖偏好實驗中，與對照組小鼠比較，模型組小鼠糖偏好程度明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2B；曠場實驗中，模型組小鼠穿越實驗中心次數較對照組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2C。

圖2 兩組小鼠的行為學實驗結果比較

2.3 兩組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10含量變化比較

前炎癥細胞因子TNF-α 和IL-6 與對照組比較明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），抗炎癥細胞因子IL-10 含量與對照組比較明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表 2 兩組小鼠血清中TNF-α，IL-6和IL-10含量比較（±s，mmol/L）

表 2 兩組小鼠血清中TNF-α，IL-6和IL-10含量比較（±s，mmol/L）

組別 n TNF-α IL-6 IL-10對照組 7 5.81±2.69 1.35±0.81 1.69±0.80模型組 35 21.08±3.22 2.73±0.67 0.83±0.53 t 值 5.149 2.490 2.444 P 值 0.001 0.034 0.040

3 討論

CUMS 是模擬抑郁癥的環境誘因，其主要通過對周圍環境改變誘發動物行為異常而建立的抑郁動物模型，其可以模擬人類抑郁癥的主要臨床癥狀，作用持久且穩定，因而被廣泛應用[12-13]。有研究表明，CUMS 模型構建過程中，隨著造模時間的延長，其體重會出現不同程度的差異[14-15]。但究其原因，各學者看法不一，部分學者認為模型組鼠體重減輕是由于出現情感抑郁，食欲不佳等原因導致體重增加變慢；另有研究認為模型組鼠體重減輕是因為在CUMS 造模過程中曾給予了禁食禁水等刺激，導致大鼠體重增長緩慢[14]。本研究中發現，0 ～4 d 時，兩組小鼠體重呈現直線增長，然而隨著刺激時間的延長，也就是造模處于5 ～24 d 的時候，模型組小鼠其體重增長趨勢明顯降低，可能是已經出現輕度抑郁，特別是第24 天時，模型組鼠較對照組鼠體重明顯下降（P＜0.05），提示造模末尾階段，模型組鼠可能已經處于抑郁狀態，表明抑郁過程中其體重變化可以作為一個評價抑郁狀態的參考指標，為抑郁癥的研究提供一定的參考依據。但本研究也有一些不足，未能在第24 天時檢測行為學變化，用以進一步明確小鼠此時的抑郁狀態，課題組將在后續實驗中完善這一驗證。

免疫炎癥反應在抑郁癥發病過程中發揮重要作用，炎癥反應實質上是機體與致炎因子進行抗爭的外在表現，而抑郁癥免疫方面的研究集中在細胞因子和免疫細胞方面[16-18]。細胞因子分為前炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子，前炎癥細胞因子在抑郁癥中的改變和作用近年來成為相關熱點研究[10]；抗炎癥細胞因子因其可能具有抗抑郁作用，日益受到研究者的關注[19-21]。本研究選用TNF-α、IL-6 和IL-10 進行監測，實驗結果顯示，在抑郁癥小鼠模型中前炎癥細胞因子TNF-α 和IL-6 與對照組比顯著升高，抗炎癥細胞因子IL-10 含量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。這表明抑郁癥的發生與免疫系統的失衡有關，抑郁癥發生能夠激活免疫系統，從而引起相關炎癥因子水平的改變，為抑郁癥的治療提供了新的研究思路，雖然本研究未對炎癥因子和抑郁癥的相關性進行驗證，但本研究論證了炎癥因子在抑郁癥的發生過程重要性，為抑郁癥發病機制和治療手段提供了新的研究基礎，后期課題組將進一步論證炎癥因子和抑郁癥的相關性，并明確具體的參與過程。

綜上所述，CUMS 所致小鼠抑郁模型能夠較好模擬抑郁過程，小鼠體重差異最早可在造模24 d 開始出現，且隨時間延長差異越顯著，而且CUMS 所致BALB/c 小鼠抑郁可能與炎癥因子的異常表達有關。本研究結果可為抑郁癥的早期臨床治療和診斷提供相關的研究參考依據，可根據這一特征在抑郁癥發病早期進行藥物或治療手段的干預，避免病程的進一步加深。