TRESK介導mTOR信號通路對大鼠脊髓神經元細胞凋亡的影響

王文康 李恒昌 陳廷鳳

廣州市第一人民醫院麻醉科，廣東廣州 510180

有研究顯示，神經病理性疼痛的發生及發展與谷氨酸及其受體相關，脊髓中的谷氨酸受體與感覺相關[1-3]。TRESK介導的神經元細胞凋亡與神經病理性疼痛發生有關[4-6]，現研究TRESK介導的mTOR信號通路對SD大鼠脊髓神經元細胞凋亡的影響。且研究認為谷氨酸作為誘導的脊髓神經元和膠質細胞與機體發生慢性疼痛具有相關性[7-8]，本研究于2018年1月至2020年1月就TRESK介導mTOR信號通路對SD大鼠脊髓神經元細胞凋亡的影響進行討論，報道如下。

1 材料及方法

1.1 SD大鼠脊髓原代神經元細胞培養

在37℃無菌環境中，將新生不超過24 h的SD大鼠（性別不限，體重5～6 g，廣東醫科大學實驗動物中心）脊髓分離并剪碎，以0.25%的胰蛋白酶（上海晶抗生物工程有限公司，JLC2128）制成單細胞懸浮液，經過濾、離心、沉淀、稀釋后于經多聚賴氨酸處理過的24孔板（美國Sigma公司）進行接種。24 h后更換為飼養培養液。4 d后加入4 μg/ml的阿糖胞苷（美國Sigma公司），處理2 d后，將阿糖胞苷更換為無阿糖胞苷（美國Sigma公司），7 d后進行相關因子的測量。

1.2 方法

100例SD大鼠的脊髓原代神經元細胞隨機分為4組，每組各25例。A組采用TRESK siRNA進行轉染，以最終濃度為20 nmol /L的mTOR特異性抑制劑進行預處理20 min，再使用100 μmol /L的谷氨酸進行24 h處理；B組用20 nmol /L的mTOR特異性抑制劑預處理后，進行24 h的100 μmol /L谷氨酸處理；D組僅使用100 μmol /L的谷氨酸進行24 h處理；C組不進行任何處理。

1.3 測定方法

1.3.1 脊髓神經元cleaved Caspase3、Bax水平的測定 用Western blot法來測定Caspase3、Bax的水平，抗體來自美國Santa Cruz公司。

1.3.2 脊髓神經元活力的測定 采用EL-311酶標儀（美國Bio Tek公司）對光密度進行測定，以光密度值反映脊髓神經元的活力。

1.3.3 脊髓神經元細胞凋亡率的測定 采用流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）對脊髓神經元細胞凋亡率進行分析。

1.3.4 脊髓神經元mTOR磷酸化水平的測定 采用ECL試劑盒（廣州吉賽生物科技有限公司）進行顯色反應后暗室內X線片曝光顯影。磷酸化mTOR比總mTOR蛋白積分光密度值的值反映mTOR磷酸化的水平。

1.3.5 脊髓神經元TRESK mRNA表達 脊髓神經元進行PCR處理后采取熔解曲線實驗，從60 ℃升溫至95 ℃。采用 2－ΔΔCt法對相對定量進行分析，計算出TRESK mRNA的表達水平。

1.4 統計學方法

采用 SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，多組間的計量資料用（）表示，采用方差分析，計量資料的兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組脊髓神經元凋亡蛋白比較

四組在脊髓神經元凋亡蛋白上的差異有統計學 意 義（P＜ 0.05）；A組、B組、D組 的 cleaved Caspase3和Bax水平均高于C組，且差異有統計學意義（P＜0.05），B組的 cleaved Caspase3和Bax水平最高，與其他組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組脊髓神經元凋亡蛋白比較（）

表1 各組脊髓神經元凋亡蛋白比較（）

注：cleaved Caspase3：#與 C 組 比 較，qA=25.845，P ＜ 0.001，qB=50.013，P ＜ 0.001，qD=32.173，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA=23.660，P＜ 0.001，qD=27.845，P＜ 0.001；△ 與 D 組 比 較，qA=2.600，P ＜ 0.05。Bax：#與 C組比較，qA =16.029，P＜0.001，qB =36.987，P ＜ 0.001，qD =42.989，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA =10.348，P＜0.001，qD =17.556，P＜0.001；△與 D組比較，qA=5.252，P＜0.001

組別 cleaved Caspase3 Bax A組（n=25） 2.17±0.20#*△ 0.51±0.07#*△B組（n=25） 3.76±0.27#△ 0.73±0.08#△C 組（n=25） 0.88±0.10 0.12±0.02 D 組（n=25） 2.04±0.15#* 0.43±0.03#*F值 963.291 506.019 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 各組脊髓神經元活力及脊髓神經元細胞凋亡率比較

四組在脊髓神經元活力及脊髓神經元細胞凋亡率上的差異有統計學意義（P＜0.05）；C組的脊髓神經元活力最高，脊髓神經元細胞凋亡率最低，與其他組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組的脊髓神經元活力最差，脊髓神經元細胞凋亡率最高，與其他組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組脊髓神經元活力及脊髓神經元細胞凋亡率比較（）

注：脊髓神經元活力：#與C組比較，qA=12.582，P＜0.001，qB=18.027，P ＜ 0.001，qD=11.036，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA=11.057，P＜ 0.001，qD=16.144，P＜ 0.001；△ 與 D 組 比 較，qA=3.841，P＜0.001。脊髓神經元細胞凋亡率：#與C組比較，qA=15.829，P ＜ 0.001，qB=35.894，P ＜ 0.001，qD=16.330，P ＜ 0.001；*與 B組比較，qA=13.017，P＜0.001，qD =19.091，P＜0.001；△與D組比較，qA =3.479，P＜0.01

組別 脊髓神經元活力 脊髓神經元細胞凋亡率（%）A組（n=25） 0.71±0.12#*△ 18.81±3.14#*△B組（n=25） 0.35±0.11#△ 29.85±2.85#△C 組（n=25） 1.57±0.32 8.52±0.84 D 組（n=25） 0.83±0.10#* 16.15±2.18#*F值 188.985 332.663 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達比較

四組在mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達上的差異有統計學意義（P＜0.05）；C組的mTOR磷酸化水平最低，與其他組比較,差異有統計學意義（P＜0.05）；B組的mTOR磷酸化水平最高，與其他組比較,差異有統計學意義（P＜0.05）；C組的TRESK mRNA表達最低，與其他組比較,差異有統計學意義（P＜0.05）；D組的TRESK mRNA表達最高，與其他組比較,差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達比較（）

表3 各組mTOR磷酸化水平及TRESK mRNA表達比較（）

注：mTOR磷酸化水平：#與C組比較，qA=20.801，P＜0.001，qB=42.485，P ＜ 0.001，qD=24.962，P ＜ 0.001；*與 B 組 比 較，qA=23.000，P＜ 0.001，qD=20.000，P＜ 0.001；△ 與 D 組 比 較，qA=3.536，P＜0.01。TRESK mRNA表達：#與C組比較，qA=6.753，P ＜ 0.001，qB=3.726，P ＜ 0.01，qD=42.464，P ＜ 0.001；*與 B 組比較：qA=2.386，P＜0.001，qD=20.209，P＜0.001；△與D組比較，qA=16.592，P＜ 0.001

組別 mTOR磷酸化水平 TRESK mRNA表達A組（n=25） 0.29±0.03#*△ 1.57±0.41#*△B組（n=25） 0.52±0.04#△ 1.30±0.39#△C 組（n=25） 0.14±0.02 1.00±0.10 D 組（n=25） 0.32±0.03#* 3.13±0.23#*F值 642.763 235.082 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

神經病理性疼痛在臨床上較為常見，臨床療效不理想，其確切發病機制尚未明確[9-12]。多個研究顯示，脊髓神經元凋亡在神經病理性疼痛發揮了作用，有研究顯示，谷氨酸是機體傳達傷害性的信息傳入時的較為重要的神經遞質之一，是目前臨床上公認導致神經細胞發生損傷和神經元凋亡的重要元素[13-15]。也有研究顯示，不同的氨基酸受體可以以不同方式對其相應的蛋白、酶類及其他神經元素發生作用，對神經病理性疼痛起到重要作用[16-17]。因此在本研究中采用谷氨酸對SD大鼠脊髓神經元進行誘導凋亡后顯示經過谷氨酸刺激的細胞活力下降且細胞凋亡率出現升高。

本研究顯示，經谷氨酸及TRESK siRNA處理后的SD大鼠cleaved Caspase3和Bax表達水平上升、脊髓神經元活力降低且脊髓神經元細胞凋亡率最高，未經處理的SD大鼠脊髓神經元cleaved Caspase3和Bax表達水平低，呈現較高的神經元活力且脊髓神經元細胞凋亡率也較低。原因為在病理條件中，機體細胞內的鉀離子水平降低，導致神經元凋亡，而鉀離子則是TRESK通道最重要的背景離子[18-20]。有研究顯示，神經病理性疼痛的SD大鼠脊髓神經元中TRESK表達降低[21]。還有研究顯示，TRESK由谷氨酸激活，本研究也顯示隨著cleaved Caspase3和Bax表達水平上升，TRESK mRNA表達下降，脊髓神經元細胞凋亡也出現增高。本研究結果顯示，谷氨酸可以對脊髓神經元的凋亡通過多個同信號通路進行介導，因此推測TRESK的水平上升可以使機體發生某種相關機制；另一方面也顯示了TRESK水平下調與脊髓神經元凋亡的發生及發展有著相關性[22]。mTOR屬于PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）類家族，是各信號通路較為重要的蛋白。脊髓損傷可以激活mTOR信號mTOR通路并且使神經元發生凋亡，且由mTOR通路主導的脊髓水平神經元凋亡參與了神經病理性疼痛的發生發展[23-24]。本研究結果顯示，在谷氨酸對脊髓神經元凋亡過程產生作用的時候，mTOR出現質變級活化，TRESK siRNA對神經元的TRESK水平起到一定程度的降低作用，隨著mTOR的活化程度加深，神經元的凋亡程度也加重，但在增加了mTOR特異性抑制劑之后就降低了TRESK siRNA對SD大鼠脊髓神經元的凋亡。

綜上所述，在由TRESK介導的mTOR信號通路，抑制谷氨酸可以誘導脊髓神經元凋亡，對神經病理性疼痛臨床上的治療方案推進等具有積極意義。