ω-異硫氰甲基長葉烯的合成、結構表征及抑藻活性

王夢竹, 藍虹云,2, 黃道戰,2*, 朱茂茂, 鄒 虹

(1.廣西民族大學 化學化工學院，廣西 南寧 530008； 2.廣西林產化學與工程重點實驗室,廣西 南寧 530008； 3.廣西民族大學醫院,廣西 南寧 530006)

異硫氰酸酯是十字花科辣根屬植物辣根的風味物質和藥效成分，其中異硫氰酸烯丙酯是最主要的成分，具有驅蟲、殺蟲、抑菌、抗癌等生物活性[1-4]，以及活潑的化學性質[5-6]，在食品、醫藥、農藥、有機合成等領域中有著廣泛應用及發展潛力。但是，天然異硫氰酸烯丙酯供給有限、易揮發流失且具有強烈刺激性，難以商品化及推廣應用。為此，人們以烯丙基鹵、烯丙基胺等烯丙型化合物為原料，通過化學轉化合成異硫氰酸烯丙酯，并采用物理包埋[7-8]、化學改性[9-10]等方法來改善其使用性能，其中，對異硫氰酸烯丙酯的烯丙基進行結構修飾或改造、引入或構筑具有協同或增強生物活性的基團，以及合成低刺激性的異硫氰酸烯丙酯類化合物受到人們的重視[11-12]。長葉烯是重質松節油的主要成分[13]，它具有較強的親脂性和低于蒎烯的揮發性，以及一定的抑藻、抗菌等生物活性[14-16]，它作為生物活性基團引入到烯丙基鹵化物、陽離子季銨鹽表面活性劑、異噻唑啉酮等類化合物中，能起到協同或增效作用[17-19]。對于分子結構簡單的異硫氰酸烯丙酯，常規合成方法是采用油水兩相混合反應工藝[20]，將烯丙基鹵與硫氰酸鉀或硫氰酸鈉的水溶液進行取代反應，生成硫氰酸烯丙酯，再經熱異構反應，轉化為異硫氰酸烯丙酯。對于烯丙基末端碳原子上連接有脂肪烷基或脂肪環烷基的烯丙基鹵，它們也可與硫氰酸鉀或硫氰酸鈉的水溶液反應，生成相應的硫氰酸烯丙酯類化合物，通過熱異構反應，也會得到異硫氰酸烯丙酯類化合物，但無法避免發生脂肪烷基或脂肪環烷基的結構變化。因此，在合成中同樣需要探索在水溶液中或熱異構反應對反應產物結構的影響。本課題組將長葉烯引入異硫氰酸烯丙酯的分子結構中，合成具有低刺激性和較高生物活性的異硫氰酸烯丙酯類化合物，為進一步拓展長葉烯的應用領域提供基礎數據。又因為此類化合物有一定抑制藻類生長的作用，可以預防藻類物質過度生長對湖泊、海洋等造成危害，因此研究該類化合物抑藻活性尤為重要。本研究介紹以ω-氯甲基長葉烯為原料與硫氰酸鉛反應合成ω-異硫氰甲基長葉烯(Ib)，采用高分辨質譜、紫外、紅外、核磁共振等波譜表征手段確定其化學結構，初步探討了其對斜生柵藻和中肋骨條藻的抑藻活性。

1 實 驗

1.1 材料

ω-氯甲基長葉烯(Ia)的合成是以85%的長葉烯為原料，按照文獻[17]的方法由實驗室自制，純度(氣相色譜峰面積歸一化法)為87.8%；硫氰酸鉛、正己烷、異硫氰酸甲酯等均為市售分析純。斜生柵藻(Scenedesmusobliquus, FACHB- 416)、中肋骨條藻(Skeletonemasp., FACHB-2260)以及相應的兩種培養基(BG11和ErdshreIaer)均購自中國科學院武漢水生生物研究所。

1.2 合成

ω-異硫氰甲基長葉烯的合成工藝路線如圖1所示。化合物Ib的合成采用溶劑加熱回流法，稱取ω-氯甲基長葉烯2.52 g(10 mmol)置于50 mL裝有回流冷凝裝置的圓底燒瓶，加入正己烷10 mL和硫氰酸鉛1.78 g(5.5 mmol)，70 ℃下磁力攪拌加熱回流反應1 h，取樣經薄層色譜(TLC)或氣相色譜(GC)分析監測反應進程。反應結束時原料峰消失且有新的峰出現，待反應混合物冷卻至室溫，過濾除去不溶性物質，濾液經水洗3次、無水硫酸鎂脫水干燥、蒸發回收溶劑，得到一種低刺激性的黃色油狀液體產品即為目標化合物。

1.3 表征

高分辨率質譜采用美國Agilent公司6500系列精確質量四極桿-飛行時間串聯質譜儀(Q-TOF)測定。紅外吸收光譜在美國Nicolet公司MagnaIR550(Ⅱ)型傅里葉變換紅外吸收光譜儀上測定，采用液膜法，掃描范圍為4000～400 cm-1。紫外吸收光譜采用翱藝儀器(上海)公司UV-1800PC型紫外-可見分光度計測定，無水乙醇為溶劑。核磁共振波譜由日本電子株式會社600M核磁共振波譜儀測定，氘代氯仿(CDCl3)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內標物。氣相色譜定量分析采用島津儀器(蘇州)有限公司GC-2014C型氣相色譜儀測定，DB-5型石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，N2為載氣，FID檢測器，AOC-20i自動進樣器。

1.4 抑藻活性實驗

1.4.1培養基的準備 移取BG11和Erdshreiber培養基各100 mL，分別加入到 250 mL錐形瓶，置于BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)中在120 ℃下滅菌大約30 min。

1.4.2藻種的預培養 將裝有藻種的試管顛倒搖勻，在無菌超凈工作臺上直接轉入三角玻璃瓶(25～50 mL)內，封口，放置在溫度25 ℃，光照強度1 000～2 000 Lux，光暗周期為12 h ∶12 h的全自動智能型光照培養箱(重慶市松朗電子儀器有限公司)，培養活化2～3天，每日搖動2～3次。活化的斜生柵藻藻種與BG11培養基按體積比1 ∶2(Erdshreiber培養基按體積比1 ∶2)接種在無菌三角玻璃瓶中，兩種藻分別培養20～30天，每日搖動2次三角瓶，待藻種生長狀態良好，生物量明顯增多，再按藻種液和培養基體積比為1 ∶5的比例進行轉接。

1.4.3樣品溶液的配制 稱取ω-異硫氰甲基長葉烯0.05 g放入4 mL的無菌試管中，加入溶劑二甲亞砜(DMSO)1 mL，溶解配制為質量濃度50 g/L的樣品溶液。移取上述樣品溶液20 μL與無菌培養基980 μL混合，配制含2%(體積分數)DMSO、質量濃度為1 g/L的ω-異硫氰甲基長葉烯樣品溶液。同法配制長葉烯、ω-氯甲基長葉烯以及對照樣品異硫氰酸甲酯溶液。

1.4.4藻種液的配制 實驗前，將預培養好的藻種液靜置半天左右，在ZHJH-C1112B型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)內取出上層清液，加入等量新培養基，充分混勻后，培養2～3天，使藻種生長處于對數生長期，取出100 mL新培養的藻種液置于250 mL無菌錐形瓶中待用。

1.4.5抑藻活性評價 以異硫氰酸甲酯為對照品，采用96孔板微量二倍稀釋法[21]分別測定ω-異硫氰甲基長葉烯、長葉烯以及ω-氯甲基長葉烯的抑藻活性。將96孔板中間6×10陣列的60個孔作為藻類活性檢測孔，向B2～B11號孔分別注入100 μL無菌培養液，再向B2和B3號孔注入100 μL的質量濃度1 g/L的ω-異硫氰甲基長葉烯樣品溶液，混勻，然后從B3號孔取出100 μL混合溶液加入到B4號孔，再從B4號孔取出100 μL混合溶液加入到B5號孔，以此類推進行梯度稀釋到B10號孔，使B2～B10號孔中樣品溶液的質量濃度依次為1 000、 500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625、 7.812 5和3.906 3 mg/L，最后再分別向B2～B11號孔中加入100 μL藻液，最終使2～10號孔中樣品溶液的質量濃度分別為500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625、 7.812 5、 3.906 3和1.953 1 mg/L，將第11列作為空白對照，最后各孔總體積達到200 μL，安排平行試驗3組。為了使微孔液柱的體積和高度不變，在微孔板四周36個孔中注入200 μL的無菌蒸餾水來防止發生邊緣效應。

將上述微孔板放入Labserv K3型酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)，設置溫度25 ℃，測讀前微孔板的振蕩時間設為5 s，打開自動校正，在波長630 nm測定光密度(OD)值。微孔板測試溶液調配完畢后，立即測定一次光密度，然后繼續放入培養箱中，在相同條件下培養，每一天定期在酶標儀上測定一次光密度，按如下公式計算ω-異硫氰甲基長葉烯對藻類生長的抑制率。

A=(OD0-ODt)/OD0×100%

式中：A—抑制率，%； OD0—初始光密度； ODt—培養第t天的光密度。

以t-A作圖，考察抑制率隨時間的變化。空白組藻類正常生長，光密度值會逐漸增大，若抑制率為負值，表明藻類生長沒有被抑制；抑制率為正值，表明藻類生長被抑制；再結合實驗孔板渾濁程度，據此推測目標化合物對藻類生長的最小抑制質量濃度(MIC)。

2 結果與討論

2.1 合成工藝的選擇

參照常規合成反應工藝，將ω-氯甲基長葉烯(Ia)與硫氰酸鉀水溶液在60 ℃下混合攪拌反應1 h，采用氣相色譜法測定油相反應混合物的組成，實驗結果如圖2(a)所示。圖2(a)有3 個主要色譜峰，經質譜及核磁共振譜分析確認，保留時間14.071 min處色譜峰對應的組分是ω-氯甲基長葉烯，保留時間19.107 min處色譜峰對應的組分是ω-異硫氰甲基長葉烯(Ib) ，而保留時間為19.071 min的色譜峰與化合物Ib的色譜峰分離度較小，難以采用精餾、柱色譜等方法高效分離，初步推測，其對應的組分是化合物Ib的同分異構體ω-硫氰甲基長葉烯(Ic)。另外，實驗發現，化合物Ic也難以通過熱異構反應轉化為化合物Ib。這表明，采用常規油水兩相混合反應工藝，難以獲得高產率的化合物Ib。

為了提高化合物Ib的產率，本課題組考察ω-氯甲基長葉烯與不同硫氰酸鹽的反應。研究結果發現，硫氰酸鹽種類和反應工藝條件對取代反應有很大影響，其中，以正己烷為溶劑，在回流加熱條件下，ω-氯甲基長葉烯能夠與硫氰酸鉛進行取代反應，生成化合物Ib。圖2(b)是ω-氯甲基長葉烯能與硫氰酸鉛反應1 h所得混合物的氣相色譜圖，僅存在一個主要的色譜峰，該色譜峰在保留時間上與圖2(a)中化合物Ib的色譜峰相一致，經質譜及核磁共振譜分析確認，對應的組分為化合物Ib，得率為92%。這表明，采用固-液兩相回流加熱反應工藝，ω-氯甲基長葉烯能夠與硫氰酸鉛進行高效快速的取代反應，高選擇性合成ω-異硫氰甲基長葉烯。

圖2 ω-氯甲基長葉烯與KSCN(a)和Pb(SCN)2(b)反應混合物的氣相色譜圖

2.2 化合物結構分析

圖3 化合物Ib的紅外吸收光譜

綜上分析，化合物Ib存在長葉烯和異硫氰酸甲酯的分子結構，可歸屬于異硫氰酸烯丙酯類化合物。

圖5 化合物Ib的1H NMR(a)和13C NMR(b)

2.3 對斜生柵藻的抑藻活性

圖6(a)～(d)分別是不同化合物在不同質量濃度下對斜生柵藻的抑制率隨培養時間變化的曲線。

a.化合物Ib compound Ib; b.化合物Ia compound Ia; c.長葉烯longifolene; d.異硫氰酸甲酯methyl isothiocyanate

由圖6(a)可知，化合物Ib能抑制斜生柵藻的生長，當質量濃度為125～500 mg/L 時，抑制率為正值，抑制率隨著培養時間的增加呈現上升趨勢，當質量濃度為62.5 mg/L時，雖然抑制率隨著培養時間的增加呈現下降趨勢，但抑制率為正值，依然有抑制作用，而當質量濃度低于31.2 mg/L，抑制率為負值，抑制率隨著培養時間的增加呈現下降趨勢，無抑制作用。結合實驗孔板渾濁程度可推知，化合物Ib對斜生柵藻生長的最小抑制質量濃度(MIC)為62.5 mg/L左右。由圖6(c)可知，長葉烯也能抑制斜生柵藻的生長，質量濃度125～500 mg/L時，抑制率為正值并隨著培養時間的增加呈現上升趨勢；當質量濃度低于125 mg/L，無抑制作用，即長葉烯對斜生柵藻的MIC為125 mg/L左右。由圖6(b)可知，質量濃度低于500 mg/L時，化合物Ia對斜生柵藻生長的抑制率均為負值，表明化合物Ia抑制作用較弱。

異硫氰酸甲酯是2種農藥棉隆和威百畝的主要藥效成分，也是目前唯一商品化的異硫氰酸酯類農藥。由圖6(d)可知，質量濃度在125～500 mg/L，異硫氰酸甲酯對斜生柵藻的抑制率為正值且隨著培養時間的延長而緩慢增加，而質量濃度低于125 mg/L時，抑制率為負值且隨著培養時間的延長而逐漸降低，結合實驗96孔板的渾濁程度，可推知其對斜生柵藻的MIC為125 mg/L左右。

2.4 對中肋骨條藻的抑藻活性

圖7(a)～(d)分別是不同化合物在不同質量濃度下對中肋骨條藻的抑制率隨培養時間的變化曲線。

a.化合物Ib compound Ib; b.化合物Ia compound Ia; c.長葉烯longifolene; d.異硫氰酸甲酯methyl isothiocyanate

由圖7(a)可知，化合物Ib明顯能抑制中肋骨條藻的生長，當質量濃度為31.2～500 mg/L時，抑制率為正值，且隨著培養時間的增加呈現上升趨勢或平穩趨勢，而當濃度低于31.2 mg/L 時，抑制率為負值，化合物Ib對中肋骨條藻生長的MIC為31.2 mg/L左右。由圖7(b)可知，化合物Ia也能抑制中肋骨條藻的生長，MIC為500 mg/L左右。由圖7(c)可知，長葉烯能夠抑制中肋骨條藻的生長，MIC為62.5 mg/L 左右。由圖7(d)可知，異硫氰酸甲酯對中肋骨條藻的生長具有弱的抑制作用，其對斜生柵藻的MIC大于500 mg/L。

3 結 論

3.1在以正己烷為溶劑的回流加熱條件下，ω-氯甲基長葉烯與硫氰酸鉛進行取代反應，高選擇性合成ω-異硫氰甲基長葉烯；產品經HRMS、FT-IR、UV、1H NMR和13C NMR進行化學組成及波譜結構表征確證為目標產物ω-異硫氰甲基長葉烯，化合物兼具長葉烯和異硫氰酸甲酯的分子結構，也可歸屬于異硫氰酸烯丙酯類化合物。

3.2ω-異硫氰甲基長葉烯能夠抑制斜生柵藻和中肋骨條藻的生長，其最小抑制濃度(MIC)分別為62.5 和31.2 mg/L左右，抑藻活性明顯高于ω-氯甲基長葉烯、長葉烯和對照樣品異硫氰酸甲酯；ω-異硫氰甲基長葉烯分子中長葉烯和異硫氰酸甲酯結構對抑藻活性具有協同或增強作用，下一步將對其進行抑菌、殺蟲等生物活性的研究。