hsa-miR-125a的靶基因預測及生物信息學分析*

楊一秋 李 蘭 趙 娜 解繼勝

1 右江民族醫學院免疫學專業在讀碩士研究生，廣西百色市 533000； 2 右江民族醫學院基礎醫學院組織胚胎學教研室

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，以降低骨量，破壞骨微結構為特征，最終引起骨骼脆弱并增加骨折風險[1]。骨質疏松癥是一種與年齡密切相關的骨骼疾病。最嚴重的后果是骨折，骨質疏松性骨折危害巨大，給老年患者的生活帶來巨大痛苦并且對于家庭和社會來說也是一個沉重的負擔。MicroRNA(miRNA)是一種內源性非編碼小分子RNA，可以降解或抑制靶基因的蛋白表達，在轉錄后水平調控中發揮重要作用[2]。前期通過miRNA芯片技術分析人外周血單核細胞向破骨細胞分化過程中差異表達的miRNA，并通過實時熒光定量PCR驗證芯片結果中上調或下調的miRNA。發現hsa-miR-125a下調最為明顯，結果提示hsa-miR-125a可能是診斷骨質疏松癥的生物標志物，但其具體調控機制還不清楚。因此，本研究擬通過生物信息學分析方法預測hsa-miR-125a的靶基因及信號通路，為進一步分析hsa-miR-125a在骨質疏松發生、發展中的調控機制提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 hsa-miR-125a的物種保守性分析 利用miRBase(http://www.mirbase.org)數據庫檢索hsa-miR-125a的序列并分析其物種保守性。

1.2 hsa-miR-125a的靶基因預測 通過TargetScan(http://www.targetscan.org)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)、miRDB(http://mirdb.org)這三個靶基因數據庫在線預測hsa-miR-125a的靶基因，對三者所預測的結果繪制venny圖，得到交集靶基因。

1.3 hsa-miR-125a預測靶基因的GO及KEGG信號通路富集分析 將hsa-miR-125a預測的靶基因集合，通過DAVID數據庫，進行基因本體(Gene ontology，GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析。GO分析包括細胞組分(Cellular component,CC)、分子功能(Molecular function,MF)和生物過程(Biological process，BP)三個部分，P<0.01為差異有統計學意義。通過Fisher確切概率法計數基因集合生物通路的P值，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hsa-miR-125a的物種保守性分析 利用miRBase數據庫在線檢索人類、小鼠、大鼠等各種物種的miRNA序列進行比對，發現miR-125a-5p序列“UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA”、miR-125a-3p“ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC”在各物種間高度保守。

2.2 hsa-miR-125a的靶基因預測 TargetScan、miRTarBase、miRDB等3個靶基因預測數據庫結果顯示，hsa-miR-125a靶基因分別有3 821、432、132個；三者交集靶基因有122個。 結果見圖1。

2.3 hsa-miR-125a預測靶基因的GO及KEGG分析 利用DAVID數據庫對預測的122個交集靶基因進行GO和KEGG富集分析。GO分析結果表明，hsa-miR-125a的靶基因主要富集在細胞質基質、細胞核、細胞質等細胞組件。參與金屬離子結合、蛋白質結合等分子功能。涉及細胞對DNA損傷刺激的反應、蛋白質泛素化的正調控等生物過程，結果見表1～3。KEGG信號通路分析結果表明hsa-miR-125a的靶基因信號通路顯著富集于endocytosis signaling pathway、adherens junction signaling pathway、TGF-β signaling pathway、HIF-1 signaling pathway，結果見表4。

圖1 miRTarBase、TargetScan、miRDB數據庫交集靶基因

表1 has-miR-125a預測靶基因的細胞組分

表2 hsa-miR-125a預測靶基因的分子功能

表3 hsa-miR-125a預測靶基因的生物過程

表4 hsa-miR-125a預測靶基因的KEGG信號通路分析

3 討論

miRNA是小的非編碼RNA，通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解在轉錄后水平調節基因的表達，在多種生理病理過程中發揮重要作用(包括腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等)[3]。多項研究[4-8]表明miRNA通過靶向不同的基因調節成骨細胞和破骨細胞的分化，從而參與骨質疏松疾病進程。前期研究證實hsa-miR-125a在破骨細胞分化過程中低表達，表明hsa-miR-125a可能是檢測骨質疏松疾病的生物標志物。但是其具體的調控機制仍然不明確。因而，本研究通過miRBase數據庫對hsa-miR-125a物種的序列保守性進行在線分析，檢索發現其在多個物種中均高度保守，說明這一段序列可能對于生物體有重要的生物學功能。再利用miRTarBase、TargetScan、miRDB數據庫預測hsa-miR-125a的靶基因，并通過DAVID數據庫進行GO和KEGG富集分析，結果表明其生物過程主要集中在細胞對DNA損傷刺激的反應、蛋白質泛素化的正調控等方面。

在KEGG信號通路分析結果中發現，hsa-miR-125a主要富集在endocytosis signaling pathway、adherens junction signaling pathway、TGF-β signaling pathway、HIF-1 signaling pathway，其中TGF-β signaling pathway在骨重塑過程中發揮重要作用。在骨吸收過程中，先前埋在骨基質中的大量因子會釋放到骨髓微環境中，從而導致骨髓間充質干細胞(MSC)的募集和分化，以用于隨后的骨形成，在時間和空間上耦合骨重塑。破骨細胞骨吸收過程中基質TGF-β的釋放與活化將MSC吸引到骨吸收部位，也就是說TGF-β的失調會改變MSC的命運，使骨骼重塑失衡引起諸如骨質疏松之類的骨骼疾病[9]。破骨細胞的分化主要受M-CSF信號、RANKL-RANK信號和基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)依賴的共刺激信號這三個重要信號通路的調節[10]。除了這三個典型的信號通路之外，TGF-β1信號在動態骨環境中起著關鍵作用，以很大程度上取決于細胞分化階段，TGF-β1濃度和其他培養條件的不同將會影響成骨細胞和破骨細胞的生長。例如，發現TGF-β1抑制成骨細胞分化，而TGF-β1的阻斷導致成骨細胞數量增加[11]。另一項研究報道，TGF-β1誘導破骨細胞凋亡[12]。但是，TGF-β1在破骨細胞形成中的確切作用仍然很復雜。前人研究表明，在低濃度(1～100pg/ml)下，TGF-β1促進破骨細胞的形成，而在高濃度(0.1～10ng/ml)下，TGF-β1抑制破骨細胞的形成[13-14]。鑒于此，我們得知不同濃度的TGF-β1和培養方式將會影響破骨細胞的活性，所以hsa-miR-125a是否可以通過靶向TGF-β信號通路中不同的基因如：SMAD2、PPP2CA、 SMAD4、RHOA等來促進破骨細胞的形成和分化，進而加速骨質疏松癥的進程，我們不得而知，還需要進一步的實驗證明。

綜上所述，本研究應用生物信息學分析方法預測了hsa-miR-125a的靶基因及信號通路，發現靶基因富集的信號通路TGF-β signaling pathway與破骨細胞分化密切相關。后期將以此作為理論及實驗基礎，進一步探索hsa-miR-125a在骨質疏松發生、發展過程中的調控機制。