咽喉反流液中胃蛋白酶在喉癌診斷及治療中的意義

陳麒竹 戴德 羅國慶

【摘要】 喉癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤，不斷地有研究證明咽喉反流是導致喉癌的致病因素之一。應用抑酸藥物治療咽喉反流物未能達到預期效果，人們發現咽喉反流物中胃蛋白酶較穩定地存在，且在非酸性環境下仍可損傷喉部黏膜細胞。在喉癌組織中胃蛋白酶的表達較正常組織增多。治療上發現胃蛋白酶抑制劑于咽喉反流治療是有效的，減少喉細胞損傷進而減少喉癌的發生。

【關鍵詞】 喉癌 咽喉反流 胃蛋白酶

[Abstract] Laryngeal cancer is a common malignant tumor in otorhinolaryngology， it has been proved that laryngopharyngeal reflux is one of the pathogenic factors of laryngeal cancer. When treatment with acid suppression drugs failed to achieve the desired effect， it has been found that pepsin is stable in the throat reflux， and it can still damage the laryngeal mucosa cells in non acid environment. The expression of pepsin in laryngeal carcinoma was higher than that in normal tissues. It is found that pepsin inhibitor is effective in the treatment of laryngopharyngeal reflux， which can reduce the damage of laryngeal cells and the occurrence of laryngeal cancer.

[Key words] Laryngeal cancer Laryngopharyngeal reflux Pepsin

First-authors address： Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.06.045

喉癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的1%～3%，占頭頸腫瘤的30%～50%，96%～98%為鱗狀細胞癌。已有大量數據證明喉癌與吸煙、飲酒兩大因素相關，隨著煙草使用的減少，喉癌的發病率在過去10年中每年下降2.4%，但是60.9%的5年生存率在過去幾年中變化不大[1-2]。主要是因為大多數患者在確診時已經是晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）[3]。通過研究的深入及拓寬，發現咽喉反流也是喉癌的致病危險因素之一[4]。咽喉反流通過胃內容物中的胃酸、胃蛋白酶及膽汁酸等對咽喉部黏膜反復刺激導致喉上皮黏膜損傷及結構的改變，長期慢性炎癥形成是咽喉反流促使喉癌發生的原因[5]。現有的研究表明，胃蛋白酶是咽喉反流的良好標記物[6]。關于咽喉反流中胃蛋白酶在喉癌診斷及治療中的作用也引起研究者的重視。

1 咽喉反流是喉癌危險因素之一

咽喉反流（laryngopharyngeal reflux，LPR）是指胃內容物反流至咽喉和上呼吸道、消化道部位，通常以食管上括約肌為界，損傷咽喉部黏膜，而導致多種耳鼻咽喉癥狀和炎癥性疾病，也可能導致咽喉腫瘤。近年來，LPR與咽喉部疾病存在密切關聯已得到廣泛認同，許多患者可在沒有食管損傷情況下（如反酸、胃灼熱），出現明顯的咽喉部癥狀，如聲嘶、咽部異物感、吞咽不暢、咽痛、慢性咳嗽等[7]。據估計，到耳鼻喉科診所就診的患者中，10%患反流性疾病，而在聲音嘶啞的患者中，有高達55%的患者有反流性疾病[8]。Langevin等[9]通過多變量分析得出，胃反流是喉癌的獨立危險因素之一。同時Parsel等[10]對18項病例對照研究進行Meta分析，得出無論吸煙和飲酒史，胃食管反流（GERD）和LPR與喉癌的存在之間存在正相關的風險。類似于慢性反流進入食管會引起炎癥-反流性食管炎，在反流性食管炎中慢性炎癥可導致細胞DNA損傷、增殖過度等細胞變性可致Barrett食管患者患食管腺癌的風險增加[11]。同樣咽喉部缺乏保護免受倒流引起損傷的防御機制（蠕動、黏液以及碳酸氫鹽屏障），LPR可引起咽喉部的炎癥性及腫瘤性病變。更有數據表示每周僅有3次反流發作可導致慢性喉損傷，而食道每天最多有50次反流發作（pH值低于4.0）被認為是正常的[8]。Bardhan等[12]認為食管外反流既可以是液體，也可以是氣體的存在，使反流在咽喉及氣道中的作用及影響更廣。

2 咽喉反流中的胃蛋白酶

為了進一步探討LPR與咽喉病變、喉癌之間的關系，一些研究者檢測了反流液的單個成分（主要是酸、胃蛋白酶和膽汁酸）對咽喉細胞生物學的直接影響。關于胃酸，有數據表示，雖然在胃食管反流中質子泵抑制劑（PPI）是首選治療用藥。但是PPI對包括LPR在內的咽喉氣道反流的治療效果不顯著[13]。通過Agrawal等[14]研究可見PPI實際上顯示出了胃灼熱等癥狀的改善，而不是慢性咽喉癥狀。同時，在一些胃切除術治療消化性潰瘍中發現，術后會增加喉癌和咽癌的風險[15-16]。Lechien等[17]通過評估先前胃切除術患者的臨床研究表明，非酸性反流的成分促進了喉癌的發展。所以鑒于缺乏數據支持PPI對LPR癥狀的有益作用，建議在沒有典型GERD與LPT癥狀的情況下，不建議使用PPI治療近端氣道反流。而關于膽汁酸則被認為反流達咽喉部的胃回流液中的生理膽汁酸濃度尚未顯示會導致喉損傷[18]。作為反流液中的主要成分胃蛋白酶引起重視，研究發現喉咽反流期間胃蛋白酶通過影響碳酸酐酶（CA-Ⅲ）和Sep 70蛋白質使喉黏膜細胞受損，變性而易于發生與返流相關的炎癥[18]，甚至誘發咽喉部腫瘤。于咽喉部非酸性環境下（pH<8），胃蛋白酶可通過附在喉細胞上，耗盡其防御能力，并通過內吞作用造成咽喉部細胞進一步的內部損傷[19]，通過實驗發現胃蛋白酶在pH值7.4時可通過改變細胞多個基因的表達水平[12]，而損害下咽上皮細胞。更有實驗證明胃蛋白酶可作為LPR診斷指標，目前Peptest新型無創性反流診斷試驗，就是通過含有兩種高特異性的人胃蛋白酶單克隆抗體，用于檢測反流病的生物標志物胃蛋白酶[20]，同時唾液胃蛋白酶也被證實可作為輔助診斷LPR的指標[21]。

3 胃蛋白酶與喉癌

研究發現，喉癌患者癌組織中胃蛋白酶陽性表達率明顯高于正常組織[22]。在喉癌組織中胃蛋白酶的表達定位在鱗狀上皮細胞或鱗狀細胞癌細胞上，以細胞胞漿表達為主，在正常人、聲帶白斑、喉癌組織中可見胃蛋白酶表達依次增高[23]。對于胃蛋白酶對咽喉部癌細胞作用，研究學者們發現雖然胃蛋白酶在pH值2.4～2.8的酸性環境下活性最大，但在非酸性（pH<8）的情況下，胃蛋白酶仍可保持穩定，所以胃蛋白酶進入咽喉部（pH值6～6.5）后可過受體介導的細胞內吞作用進入到細胞內，儲存于pH較低細胞內囊泡保留其穩定性，隨后運送至細胞內復雜的細胞器（如線粒體等），當咽喉部反流事件再次發生，咽喉部pH值降低到5以下，胃蛋白酶可以重新被激活而損傷細胞，使細胞內線粒體腫脹變形[24]，使細胞內ROS（活性氧）生成增加，刺激IL-1和IL-8炎性細胞因子表達上調，擴大炎性反應，誘導DNA損傷，影響喉上皮細胞基因組穩定性，進而導致細胞變性及死亡。當用NADPH氧化抑制劑或ROS清除劑預處理后，胃蛋白酶的ROS生成量、線粒體損傷、炎性細胞因子分泌及DNA損傷顯著減少[25-28]。

體外研究發現，胃蛋白酶在促進喉癌細胞系的Hep-2和Tu212細胞的增殖，集落形成，遷移和IL-8分泌[27]。胃蛋白酶濃度的增加改變了Hep-2和Tu212細胞的形態。通過誘導上皮細胞-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發生而致細胞由上皮性多邊樣向間質性纖維樣改變。隨著胃蛋白酶濃度的増高，上皮標志物E-cadherin表達下調，間質標志物Vimentin、P-catenin表達上調。Johnston等[26]發現胃蛋白酶顯著改變了與致癌作用有關的27個基因及，22個microRNA的表達，增加S期分布，造成細胞癌變。最近在用胃蛋白酶處理咽喉部癌細胞增殖時發現，在誘導G1/S過渡過程中NF-κB、TRAIL和NOTCH信號的變化可能參與了咽喉癌細胞增殖、分化和凋亡[28]。

4 檢測胃蛋白酶的方法

目前檢測咽喉反流主要有反流體征評分量表（reflux finding score，RFS）和反流癥狀指數量表（reflux symptom index，RSI）[29]，但容易受主觀因素的影響，特異度和敏感度均不高。而24 h食管、咽喉雙探頭pH監測[30]，為有創性操作且檢查時間較長，被患者接受度較低。而胃蛋白酶是一種蛋白水解酶，其前體胃蛋白酶原僅由胃主細胞釋放。它出現在食管或更近端（咽或氣道）提示胃食管反流（GOR）。胃蛋白酶無論在酸性或非酸性咽喉反流中（pH<8）均能較穩定地存在，這使得胃蛋白酶非常適合作為檢測臨床樣本中反流的生物標志物[31-32]。Peptest新型無創性反流診斷試驗，是通過含有兩種高特異度的人胃蛋白酶單克隆抗體而用于檢測唾液中反流病的生物標志物胃蛋白酶。Peptest的敏感度較高，但某些中心的特異度較低，總體上只有中等的特異度，可結合RFS、RSI調查表進一步診斷。Weitzendorfe等[6]在對70例與LPR相關的主要癥狀的患者進行胃鏡、唾液胃蛋白酶及RSI檢查，唾液胃蛋白酶在使用216 ng/mL的最佳臨界值診斷LPR時顯示出86.2%的特異度和41.5%的敏感度。此外，唾液胃蛋白酶值與RSI得分之間存在顯著相關性（r=0.344，P=0.046）。在我國，Du等[32]對250例有GERD癥狀的患者和35例無癥狀唾液胃蛋白酶監測，在胃蛋白酶測試的最佳臨界值為76 ng/mL，對GERD診斷的敏感度為73.0%，特異度為88.3%。血清胃蛋白酶原（PG）是由胃黏膜腺體細胞中高爾基體分泌出細胞進而入胃腔，PG可經胃酸激活為胃蛋白酶。而胃腔內約1%的PG又可經胃黏膜的毛細血管進入到血液循環，PG在血液中非常穩定[33]。已有大量研究表明，血清胃蛋白酶原水平的升高或下降與胃部及食管疾病具有相關性[34-35]。咽喉部黏膜相較于胃部及食管，缺乏黏液-碳酸氫鹽屏障，更易被反流液損傷，喉癌與胃血清蛋白酶原的關系被人重視。張義等[36]研究提示喉癌患者血清PGⅠ、PGR水平較正常人低。目前血清胃蛋白酶原可通過酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）、放射免疫分析法（RIA）、時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）、乳膠增強免疫比濁法、光激化學發光免疫分析法等檢測。

5 治療咽喉反流，預防喉癌發生

咽喉反流液體中主要為胃酸、胃蛋白酶及膽汁酸等對咽喉部黏膜反復刺激導致喉上皮黏膜損傷及結構的改變。針對胃酸作用，臨床上常使用質子泵抑制劑（PPI）等抑酸藥物治療，但并未達到預期效果[37]。胃蛋白酶被證明在咽喉反流中的作用[17]，針對作用于胃蛋白酶的靶向治療有望成為治療反流的新方法，其主要通過以下兩方面：（1）使胃蛋白酶原被激活前不可逆失活;（2）通過受體拮抗劑阻止受體介導的胃蛋白酶攝取這兩方面研究胃蛋白酶靶向治療藥[33]。研究發現姜黃素、依卡倍特鈉和黑樹莓提取物可抑制胃蛋白酶活性和胃蛋白酶誘導的線粒體損傷和增殖。其中姜黃素主要通過消除胃蛋白酶介導的抑制腫瘤基因表達的作用，改變了內吞作用后胃蛋白酶的亞細胞定位[38]。對于頑固的咽喉反流，藥物治療無效，又嚴重影響日常生活，明顯咽喉部損傷而促進咽喉部腫瘤的發生時，可以選擇手術治療。腹腔鏡抗反流手術（LARS）在部分咽喉反流患者治療中療效得到肯定[39]。

喉癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，盡管醫學治療不斷發展進步，其死亡率仍未見明顯下降，主要是未能及時預防及早期發現。目前研究表明咽喉反流是喉癌的致病因素之一，而胃蛋白酶被認為是咽喉反流中損傷咽喉部細胞而引起喉癌的主要作用成分，可通過檢測胃蛋白酶來提高LPR的檢出率。對于通過防止咽喉反流對咽喉部細胞的損傷而減少喉癌的發生，關于胃蛋白酶抑制劑的進一步研究將成為喉癌防治的重要研究方向。

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（收稿日期：2020-11-23） （本文編輯：程旭然）