角膜緣保護技術在經上皮角膜交聯術中的應用效果

王萌萌，王晶晶，劉延東，李明然，尹會蘇，張印博，董興國

0引言

角膜交聯(corneal collagen cross-linking，CXL)是一類提高角膜生物力學強度和對抗生物降解能力的新型技術，目前專指已經在眼科臨床上應用的紫外光-核黃素(riboflavin)角膜交聯手術技術。CXL采用370nm的紫外光A照射被核黃素浸潤的角膜，可以使角膜纖維之間發生共價鍵結合，提高了膠原纖維的生物力學強度和生物學穩定性，主要用于治療圓錐角膜、大泡性角膜病變、角膜炎等疾病[1]。大量研究已經表明，CXL能夠有效阻止圓錐角膜的進展，是目前圓錐角膜綜合治療措施中的重要組成部分。CXL的主流術式有兩種，即經典的去上皮角膜交聯(epithelium-off CXL，Epi-off CXL)和經上皮角膜交聯(epithelium-on CXL，Epi-on CXL)。Epi-off CXL又被稱為Dresden方案，是最早提出的經典角膜交聯方案，由于角膜上皮層的細胞間緊密連接阻礙了光敏劑核黃素滲透進入角膜基質層，需要術中人為去除角膜上皮層，因此不可避免地帶來了術后疼痛和角膜上皮愈合問題；Epi-on CXL又被稱為跨上皮角膜交聯(transepithelial corneal collagen cross-linking，TECXL)，是采用化學和電滲等方法促進核黃素進入角膜基質層，由于術中不用去除角膜上皮，所以術后不適感較輕，視力恢復也較快。其中化學法是在核黃素溶液中加入苯扎氯銨或乙二胺四乙酸(EDTA)等化學促滲劑。這些化學促滲劑能夠引起角膜上皮細胞間的緊密連接發生斷裂，導致角膜上皮疏松，便于核黃素的滲透。與電滲法相比，化學法不需要特殊儀器，所以在國內外應用較多[2]。

盡管CXL對圓錐角膜具有明顯的防治作用，但是該手術的安全風險依然不能被忽視，尤其是紫外光A[3]和化學促滲劑[4]都具有一定的組織毒性，CXL本身也會引起治療部位組織細胞的死亡[5]。基礎研究已經發現CXL手術可造成角膜緣干細胞的損傷，并建議在術中對角膜緣進行必要的保護[6]，然而目前國內外尚未見有關角膜緣保護的臨床研究報道。我院自2015年開展CXL手術以來，一直重視術中對角膜緣的保護。本研究將對治療圓錐角膜的Epi-on CXL術中使用的一種角膜緣保護技術的臨床應用效果進行評估。

1對象和方法

1.1對象本研究為前瞻性臨床研究。選取2019-01/12河北省眼科醫院收治擬行Epi-on CXL手術的雙眼進展期圓錐角膜患者15例30眼，其中男8例，女7例，平均年齡20.2±1.8歲。右眼15眼納入試驗組，Epi-on CXL術中采用角膜緣保護技術；左眼15眼納入對照組，Epi-on CXL術中不采用角膜緣保護技術。納入標準：(1)年齡大于18周歲；(2)明確診斷為雙眼進展期圓錐角膜；(3)中央角膜厚度大于400μm；(4)雙眼行Epi-on CXL手術。排除標準：(1)伴有其它眼部合并癥；(2)患有全身系統性疾病；(3)有眼部感染史；(4)有眼部手術史；(5)有眼部外傷史；(6)有軟性或硬性角膜接觸鏡配戴史。本研究經過河北省眼科醫院醫學倫理委員會的許可實施，手術前每位患者及其家屬均充分理解該研究的意義和手術風險，并自愿簽署科研和手術知情同意書。

1.2方法

1.2.1手術方法所有患者術前3d均采用5g/L左氧氟沙星滴眼液點眼，每天4次。Epi-on CXL手術均由同一名手術醫師(第一作者)采用KXL紫外光交聯系統完成。眼部消毒、鋪巾、開瞼，表面麻醉。試驗組首先在角膜緣和球結膜表面注射薄薄的一層醫用透明質酸鈉凝膠，在角膜表面居中放置已滅菌的自制不銹鋼金屬環(內徑9.0mm，外徑13.0mm，厚2.0mm)，用蘸有生理鹽水的海綿將金屬環中央孔內露出的角膜表面擦拭干凈后滴加0.25%核黃素透上皮配方溶液(含乙二胺四乙酸、堿式氯化鋁等化學促滲劑)至覆蓋住裸露的角膜表面，注意不要讓核黃素溶液從角膜和金屬環表面流下來(圖1)。浸泡角膜240s后生理鹽水沖洗并蘸干角膜，滴加0.25%核黃素鹽溶液(不含化學促滲劑)浸泡360s，再次生理鹽水沖洗并蘸干角膜。采用370±5nm紫外光A照射角膜表面160s，光斑直徑9mm，照度45mW/cm2，能量密度7.2J/cm2，照射過程中適時滴加生理鹽水以保持角膜表面濕潤。試驗組角膜表面的金屬環自手術開始時放置，直至紫外光照射結束取下。對照組不放置金屬環，直接在角膜表面滴加0.25%核黃素透上皮配方溶液使之覆蓋住全部角膜表面，將流淌進入結膜囊內多余的0.25%核黃素透上皮配方溶液用棉簽擦除，其余用藥和紫外光照射步驟同試驗組。兩組術后均采用5g/L左氧氟沙星滴眼液點眼，4次/天，共14d；1g/L玻璃酸鈉滴眼液點眼，4次/天，共14d；1g/L氟米龍滴眼液點眼，4次/天，共7d，每周遞減1次，持續4wk。

圖1 在Epi-on CXL手術中采用的角膜緣保護技術 術中治療區域外的眼球表面涂抹醫用透明質酸鈉凝膠，并在角膜上放置自制的不銹鋼金屬環，該技術能夠防止含有化學促滲劑的核黃素溶液滲漏到非治療區域的角結膜表面，并能遮擋角膜緣以避免紫外光的輻射損傷。

1.2.2隨訪觀察隨訪并記錄術前、術后7d，3mo時兩組最佳矯正遠視力、散光度、角膜曲率Sim-K平均值(Km) 、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間，其中Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間均采用Sirius眼前節分析系統檢測獲得。術后7d時，采用患者主觀評分法評估術后不適感，總分0～9分，0分為無不適，9分為非常痛苦。隨訪期間，觀察并記錄兩組角膜上皮愈合時間。

統計學分析：采用IBM SPSS Statistics 23統計軟件包進行數據分析。計量資料的統計描述采用均數±標準差表示，采用重復測量設計的廣義估計方程比較手術前后兩組最佳矯正遠視力、散光度、Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間的差異；采用配對樣本t檢驗比較兩組術后不適感和術后角膜上皮愈合時間的差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

手術前后不同時間點兩組最佳矯正遠視力、散光度、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間比較，均具有時間差異性(χ2=17.010、6.500、829.489、52.230，P<0.001、=0.039、<0.001、<0.001)。其中，術后3mo時的最佳矯正遠視力優于術前和術后7d，差異均有統計學意義(P<0.05)；術后3mo時的散光度小于術前，差異有統計學意義(P=0.043)；與術前相比，術后7d，3mo時角膜最薄點厚度差異均有統計學意義(P<0.001)；與術前相比，術后7d時淚膜破裂時間變短，隨后盡管有所恢復，但依然小于術前，差異均有統計學意義(P<0.001)，見表1、2。兩組手術前后不同時間點Km無時間差異性(χ2=0.437，P=0.804)。此外，手術前后不同時間點兩組最佳矯正遠視力、散光度、Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間比較，均無組間差異性(χ2=0.515、0.112、1.227、0.041、0.416，P=0.473、0.738、0.268、0.839、0.519)，時間與組間也無交互作用(χ2=2.134、0.277、2.687、3.973、0.572，P=0.344、0.870、0.261、0.137、0.751)。

表1 手術前后各觀察指標檢測結果

表2 廣義估計方程中各觀察指標時間差異分析結果

試驗組和對照組術后不適感評分分別為3.13±0.99、3.33±1.23分，差異無統計學意義(t=0.764，P=0.458)。試驗組術后角膜上皮愈合時間(3.20±0.56d)比對照組(3.73±0.96d)短，差異有統計學意義(t=2.256，P=0.041)。

3討論

角膜緣是保障角膜上皮細胞動態平衡的重要部位，對維持角膜透明性和眼表完整性起到了重要作用[7]。其中，角膜緣Vogt柵欄結構區被認為是角膜緣干細胞之所在。各種原因導致的角膜緣干細胞受損和缺乏會引起角膜和眼表功能障礙[8]。盡管大量臨床研究已經證實CXL手術在防治圓錐角膜方面的有效性和安全性[9]，但是依然不能忽視CXL手術可能引起的角膜緣損傷。基礎研究發現，CXL具有細胞毒性作用，不僅能夠降低角膜緣部位上皮細胞的擴增能力[10]，而且會引起細胞凋亡[11]。臨床研究也有關于CXL術后發生角膜緣干細胞失代償[12]、角膜上皮延遲愈合[13]、誘發眼表腫瘤[14-15]等個別病例的報道，提示CXL術中保護角膜緣的重要性。

與以往研究[1-2]結果相似，本研究中，無論是否采用角膜緣保護技術，患者術后3mo時最佳矯正遠視力、散光度均優于術前(P<0.05)；兩組術后角膜最薄點厚度均逐漸減小(P<0.05)；兩種Epi-on CXL手術均造成術后短期(7d)淚膜破裂時間縮短，盡管在術后中期(3mo)時有所恢復，但依然低于術前水平(P<0.05)。本研究試驗組所采用角膜緣保護技術未對Epi-on CXL手術患者的最佳矯正遠視力、散光度、Km、角膜最薄點厚度、淚膜破裂時間、術后不適感方面造成顯著影響，說明此種角膜緣保護技術并不能提升Epi-on CXL手術治療圓錐角膜的臨床療效。然而，本研究結果顯示此種角膜緣保護技術能夠縮短術后角膜上皮愈合時間，提示該技術可能在降低Epi-on CXL手術源性損傷、保護角膜緣組織、維護角膜上皮修復能力方面具有重要的保護作用，并能夠提高Epi-on CXL手術的安全性。

目前國外研究者已經開發和報道了幾種CXL術中角膜緣保護技術。相比而言，本研究所采用的角膜緣保護技術具有操作簡單、效果確切、成本低廉、器材可重復使用等諸多優點。Lee等[16]通過動物實驗驗證CXL術中采用一種直徑為9mm的金屬擋圈(retention ring)限制核黃素溶液擴散到角膜緣，從而使角膜緣干細胞免于受到CXL的損傷。需要強調的是，上述動物實驗研究中使用的金屬擋圈需要術者手持并施壓于眼球，其保護角膜緣的原理只是阻止核黃素溶液對角膜緣浸潤，并沒有在術中對紫外光進行遮擋，因此無法避免術中紫外光輻射性損傷；使用金屬擋圈的動物眼角膜發生了較為嚴重的炎癥反應，作者推測可能與核黃素潴留引起過度的交聯反應有關，也可能是由于金屬擋圈對角膜的壓迫引起的。本研究使用的自制不銹鋼金屬環無需手持，其與角膜表面的貼敷是依靠金屬環的自身重量和眼球表面醫用透明質酸鈉凝膠的黏附作用。術中該金屬環能夠阻止核黃素溶液滲漏到角膜緣和結膜囊；由于該金屬環具有一定的寬度，所以能夠托起足夠的核黃素溶液覆蓋住裸露的角膜表面；該金屬環的寬度能夠遮擋角膜緣，從而保護角膜緣免受紫外線的直接照射。本研究未發現試驗組出現Lee等[16]在其動物實驗中發生的比對照組更為嚴重的炎癥反應，我們推測由于本研究所使用的金屬環不需要手持和施壓，因而可能對眼部的刺激性較小。

Jeyalatha等[17]在離體人眼實驗中使用了一種聚甲基丙烯酸甲酯制成的透明遮擋環，發現該遮擋環能夠保護角膜緣干細胞免受CXL術中紫外線的輻射損傷。Bilgihan等[18]采用角膜接觸鏡中央打孔的方法制作了一種簡易的角膜緣遮擋環，并使用激光照度計檢測證實了該中央打孔的角膜接觸鏡能夠有效阻斷紫外線的穿透，但是沒有在其研究中提及該方法的臨床應用效果。與以上兩種術中角膜緣保護技術相比，本研究使用的保護技術具有以下可能的優勢：本研究使用的金屬環不僅遮光更徹底，而且具有一定的重量，能夠穩定地放置在角膜上，不容易受到眼球不自主運動的影響而發生移動；除了金屬環自身重量的作用之外，醫用透明質酸鈉凝膠能夠更好地封閉金屬環與角膜之間的間隙，有效防止核黃素溶液滲漏到角膜緣，進而可以避免核黃素溶液中化學促滲劑對角膜緣的毒性損傷，因此尤其適合在Epi-on CXL手術中使用。此外，已有研究證實透明質酸鈉本身也能夠降低化學滲透劑EDTA對人角膜上皮細胞造成的氧化損傷[19]。因此，本研究中使用的角膜緣保護技術比以往研究中提及的金屬擋圈技術、聚甲基丙烯酸甲酯環技術和中央打孔的角膜接觸鏡技術等更具臨床推廣價值。

本研究的主要不足之處在于病例數較少、隨訪時間較短，因此除了術后角膜上皮愈合時間外，未發現試驗組和對照組更多的差異。然而，由于CXL手術是一項較為安全的手術技術，其本身發生角膜緣干細胞損傷相關的臨床病例較少，所以術中角膜緣保護技術的重要作用可能很難在臨床研究中顯現出來。此外，本研究僅對該角膜緣保護技術的臨床療效進行了分析，未開展在角膜緣細胞活性、細胞形態、核黃素浸染程度等方面的基礎性研究來加以佐證。今后我們將繼續深入研究，不僅努力收集和納入更多的病例、延長隨訪時間，并且對以上幾種術中角膜緣保護技術進行深入比較，以期望為廣大手術醫師提供更多的臨床應用參考。

總之，本研究中所采用的術中角膜緣保護技術能夠縮短Epi-on CXL術后角膜上皮愈合時間，初步證實了該術中角膜緣保護技術在Epi-on CXL手術中應用的可行性和安全性，其長期的臨床應用價值有待今后進一步研究加以驗證。