細胞熱遷移分析技術及其在靶標發現中的應用進展

徐雨昕，季靜靜，張巧艷，秦路平，張泉龍

(浙江中醫藥大學藥學院中藥資源教研室，杭州 311402)

生物活性小分子的蛋白質靶點鑒定和分子作用機制的闡明是藥理學與毒理學研究的重要內容之一。明確化合物的作用靶點是藥物研發的關鍵步驟，有助于闡明其作用機制，發現可能的毒性機制，并有針對性地進行結構優化和改造。隨著基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等技術的發展，新的藥物靶標發現技術不斷涌現，各有優勢。如以化合物為中心的化學蛋白質組學(compound-centric chemical proteomics,CCCP)、基于活性的蛋白質分析(activity-based protein profiling,ABPP)[1]等方法，但這些方法需要對化合物進行標記，易導致化合物活性減弱或阻礙化合物與靶點的結合。近年來，基于蛋白質穩定性變化的生物物理學方法開發了無需對小分子化合物進行改造的靶標篩選技術，如基于蛋白酶解穩定性開發的依賴于靶點穩定性的藥物親和反應(drug affinity responsive target stability，DARTS)技術，以及根據蛋白質氧化穩定性開發的基于氧化速率的蛋白質穩定性測試(stability of proteins from rates of oxidation，SPROX)技術，用于化合物蛋白質靶標的發現，但由于技術限制，這些技術尚未得到廣泛使用。

細胞熱遷移分析(cellular thermal shift assay，CETSA)技術是近年來開發的一種新型藥物靶標發現技術，其原理是當靶蛋白與藥物分子結合時，靶蛋白通常會變得穩定，不容易被熱變性[2]。CETSA技術無需任何蛋白質或小分子標記，可用于研究小分子對全細胞裂解物、細胞及組織中蛋白質的熱穩定性影響。早期CETSA技術用于鑒定預知可能的靶蛋白，并且一次只能檢測少量蛋白質，但隨著CETSA技術與高分辨質譜技術的結合，可以在沒有任何預知的情況下識別多個靶蛋白，并且允許研究者在短時間內研究擾動對數千種單個蛋白質的影響。本文重點討論CETSA技術的原理、方法及其在藥物靶標發現中的應用進展。

1 CETSA技術的原理及方法演變

瑞典Karolinska研究所團隊依據蛋白質和藥物結合時熱穩定性有所提高的特征，首次開發了一種稱為CETSA的實驗方法[2]，可以直接在細胞或組織內檢測藥物和靶標蛋白的結合親和力，為直接在細胞或組織內檢測藥物和靶標蛋白的相互作用、跟蹤藥物的遷移、脫靶效應以及耐藥性開辟了一條新途徑。該方法主要包括以下步驟：(1)樣品準備；(2)藥物干預；(3)熱反應；(4)蛋白質提取；(5)蛋白質鑒定;(6)數據處理。見圖1。

圖1 細胞熱遷移分析(CETSA)的操作流程圖

1.1 樣品準備 細胞裂解液、完整細胞或組織樣品均可用于CETSA實驗。采用細胞裂解液處理可用于發現藥物直接作用的靶標蛋白；采用完整細胞處理可同時發現藥物作用細胞的直接靶點及其下游效應蛋白。細胞裂解液實驗是細胞先裂解，后熱處理；完整細胞實驗是先熱處理，后裂解。如抗菌藥TH1579能夠穩定MTH1蛋白。然而，在完整細胞，TH1579還能夠穩定脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase，dCK)，一種從降解DNA中回收脫氧核苷的酶。其原因為MTH1抑制劑能夠促進DNA損傷，導致脫氧核苷蓄積，引起dCK熱穩定[3]。

1.2 藥物干預和熱處理 藥物干預可以采用單一濃度或梯度濃度。單一濃度的藥物干預后，采用一系列梯度溫度進行熱遷移，稱為熱遷移分析實驗，能夠檢測出一個化合物的主要靶標。如采用該方法能夠發現十字孢堿抑制的49個激酶(已知66個)[4]，經過熱遷移分析，這些激酶的熱遷移值(Tm,即某種蛋白質絕對量減少一半時的溫度)遷移度均>1 ℃。但Tm的大小并不能代表配體與激酶的親和力，因為Tm的改變一方面受配體與激酶的親和力影響，另一方面還由激酶自身的熱穩定性決定。

為評價配體與激酶的親和力，可采用等溫劑量反應(isothermal dose-response,ITDR)分析。該方法采用一系列梯度濃度藥物干預細胞，并加熱到一個恒定的溫度進行。K562細胞提取物與一系列濃度的GSK3182571反應，加熱至53 ℃進行等溫劑量反應實驗，其測得的親和度與Kinobeads競爭性結合實驗結果之間表現出良好的一致性[4]。

二維蛋白質組熱穩定性分析(two-dimensional thermal proteome profiling,2D-TPP)是近年來新出現的技術[5]。該方法中細胞與一系列濃度的化合物反應，同時采用不同溫度進行熱處理，從而使靶標識別的分辨率更加靈敏，化合物與靶標的親和力測定更加快捷。2D-TPP可以使藥物干預組與未干預組在同一質譜條件下進行定量，得到更加精確的量化指標，同時增加了在不同濃度下蛋白質的穩定性考察，增加了對數據的質控，過濾了假陽性結果。Becher等[5]首次采用2D-TPP發現了panobinostat的脫靶(off-target)苯丙氨酸羥化酶。

1.3 可溶性蛋白質的提取 根據CETSA的原理，藥物與靶標蛋白質結合后使蛋白質變得穩定，經過熱處理后，孵育體系中蛋白質與配體(如藥物分子)結合后仍保持折疊狀態，變得相對穩定,而沒有結合配體的蛋白質會解折疊，從而迅速變性、聚集產生沉淀。這些不穩定的蛋白質經低溫超速離心(相對離心力1.0×104×g～1.0×105×g)可以去除。該過程中裂解液的選擇尤為關鍵，裂解液的作用是為了提取細胞中更多的蛋白質，同時使蛋白質在整個處理過程中變得穩定。常用的裂解液包括加有混合蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)裂解液，非變性裂解液[pH 7.5，含0.05 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，0.005 mol/L β-甘油磷酸鈉,0.000 1 mol/L Na3VO4,0.01 mol/L MgCl2,0.002 mol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP),蛋白酶抑制劑]。在最初的操作規程中，膜蛋白因其不溶性而未能得到分析。為獲取膜蛋白，可在裂解液中添加0.4%NP-40。NP-40是一種能溶解膜蛋白的洗滌劑，不影響細胞質中蛋白質成分的溶解性。同時添加0.4% NP-40不改變細胞中蛋白質的Tm[6]。Reinhard等[6]在CETSA實驗中將含0.4% NP-40的PBS作為裂解液，發現過釩酸鈉作用于膜蛋白CD45及其下游通路。Hashimoto等[7]采用CETSA技術篩選膜蛋白-人溶質載體家族16成員1(SLC16A1)的抑制劑，0.5%十二烷基-β-D-麥芽糖苷也被用于膜蛋白裂解液，其對SLC16A1的穩定性優于NP-40裂解液。

1.4 蛋白質鑒定 早期CETSA技術更多通過免疫印跡(Western blot)實驗應用于靶標驗證工作,因此必須依賴合適的目標靶蛋白抗體,無法預測未知靶蛋白。隨著平行多通道定量蛋白質組學技術(iTRAQ/TMT)的發展,來自歐洲分子生物學實驗室的Savitski研究組將CETSA技術與高分辨質譜技術相結合，推出一種全新的基于蛋白質熱穩定性的高通量靶標篩選方法——蛋白質組熱穩定性分析(thermal proteome profiling,TPP)技術，又名MS-CETSA[4]。該技術具有無偏見性、靈敏度高等優點。TPP技術通過對經熱處理后獲得的可溶蛋白質進行酶解，并對肽段進行穩定同位素標記，將不同溫度處理的樣品混合后進行離線肽段分級,最后利用定量質譜分析肽段的相對含量并得到每個蛋白質在小分子處理組和對照組的熱熔曲線，通過擬合熱熔曲線計算蛋白質的Tm。TPP法主要為獲取不同溫度、不同濃度或不同細胞狀態條件下蛋白質的變化趨勢，計算蛋白質熱熔曲線、Tm值、pEC50值(半數最大有效濃度的對數值)等，亦有通過計算熱遷移面積f(T)評價蛋白質熱遷移的報道[8]。常用的數據處理R軟件包包括：mineCETSA[8]、TPP[9]、mstherm (https://CRAN.R-project.org/package=mstherm)。

此外，Park 研究組開發了一種基于二維熒光凝膠差異的熱穩定性分析技術(thermal stability shift-based fluorescence difference in two-dimensional gel electrophoresis,TS-FITGE)[10]。該方法在熱處理并高速離心獲得可溶性蛋白質后，將不同熒光標記試劑分別加入對照組(Cy3,綠色)和實驗組(Cy5,紅色)。將相同處理溫度的實驗組和對照組物質混合并進行二維電泳,再經圖像自動處理可以得到混合點的兩種熒光標記的比值并定量。與采用TMT標記的TPP方法相比,TS-FITGE 技術的最大優勢在于無需使用成本較高的穩定同位素標記試劑，在發現目標候選物上存在互補性，但從操作方法和數據分析上，TPP法更為簡便、靈敏，可直接完成目標蛋白質的定量定性分析。CETSA及TPP的應用情況見表1[2,4-6,8,11-20]。

2 CETSA技術在藥理學與毒理學中的應用

2.1 藥物靶標的確證及藥物親和力分析 CETSA技術的優點在于可以從細胞裂解液、活細胞或組織中驗證藥物與靶蛋白的相互作用。通過藥物濃度的遞增或熱反應溫度的梯度遞增，結合Western blot技術檢測靶蛋白的熱熔曲線及等溫劑量反應曲線評價藥物與靶蛋白的結合力。近年來，將CETSA技術與高內涵影像(high content imaging)[21]、高內涵免疫熒光檢測(high content immunofluorescent，HCIF)[22]、 分裂納米熒光素酶法(split nano luciferase approach，SplitLuc)[23]、 Nanoluc檢測法[24]等方法相結合，開發出一系列高通量藥物靶點篩選方法，已成功用于p38α抑制劑[25]、B-Raf和聚(ADP-核糖)聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1)蛋白抑制劑[26]、雄激素受體藥物親和力[27]、細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase,CDK2)抑制劑[23]的篩選研究。

表1 CETSA及TPP的應用情況匯總

2.2 藥物脫靶的發現 藥物脫靶效應即藥物設計之外的額外靶點，是導致藥物副作用的主要原因。Savitski等[4]采用TPP法發現了幾個蛋白酶抑制劑(如絲氨酸酶抑制劑維羅非尼，間變性淋巴瘤激酶抑制劑阿來替尼)中與毒性相關的脫靶——亞鐵螯合酶(ferrochelatase)。亞鐵螯合酶是血紅素生物合成中的末端酶，已知該酶的失活變性會導致紅細胞生成性原卟啉癥，從而導致肝損傷和嚴重的光敏反應。這也是維羅非尼產生光敏性副作用的原因。

2016年，Becher等[5]采用2D-TPP法研究抗癌藥物組胺去乙酰化抑制劑帕比司他(panobinostat)，除了已知靶點外，還發現了一些未知靶點，如苯丙氨酸羥化酶[5]。細胞實驗也證實帕比司他能增加細胞內苯丙氨酸的濃度，減少酪氨酸生成，這與其有效抑制苯丙氨酸羥化酶相關。這些發現為解釋臨床患者使用帕比司他后出現甲狀腺激素水平降低的不良反應提供了理論依據。

2.3 病原菌藥物靶點的確證 TPP可用于研究細菌細胞中大多數蛋白質的活性和結構，以及藥物對細菌的影響。Mateus等[15]將MS-CETSA(又名TPP)法成功用于考察大腸桿菌(Escbericbiacoli)的生長周期變化及抗菌藥物的分子作用機制，在細胞裂解液及活細胞內發現了氨芐西林的作用靶點青霉素結合蛋白家族成員(MrcA、DacB等)，并且發現氨芐西林耐受的β-內酰胺酶AmpC也是氨芐西林的作用靶點。

Dziekan等[17]利用MS-CETSA法對人瘧疾的主要致病原惡性瘧原蟲進行了藥物靶向鑒定，發現惡性瘧原蟲嘌呤核苷磷酸化酶(Plasmodiumfalciparumpurine nucleoside phosphorylase，PfPNP)是抗瘧藥物奎寧和甲氟喹的共同結合靶點。

2.4 細胞內物質與蛋白質相互作用的發現 三磷酸核苷酸(nucleosides triphosphate，NTPs)在細胞的生化過程中起著非常重要的作用，三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)是細胞中最豐富的NTPs。Sridharan等[28]利用CETSA法與多重定量質譜相結合，通過設置一系列ATP濃度及溫度處理細胞，在蛋白質層面上得到ATP相關二維熱蛋白質圖譜，從而揭示蛋白質組中ATP濃度依賴性的蛋白質穩定性。

蛋白質之間的相互作用在不同的細胞狀態和條件下是不斷變化的，由蛋白質相互作用形成的蛋白質復合物在細胞中發揮著重要的作用。Tan等[29]利用多維TPP法分析細胞中的蛋白質復合物發生的動態變化。其利用多維TPP法確定上千種蛋白質的熱熔曲線，然后基于這些熱熔曲線之間的相似性，采用熱鄰近共聚合(thermal proximity coaggregation，TPCA)技術高通量監測細胞內蛋白質復合物動力學。這種方法在很多已知的蛋白質復合物中得到驗證，可用來高通量地監控細胞內的蛋白質復合物動態變化。這些研究人員利用TPCA法鑒定出很多沒有差異性蛋白質表達的蛋白質復合物，如在細胞周期的S期受到調節的染色質結合蛋白質復合物。他們還利用這種方法鑒定出6種細胞系中的細胞特異性的蛋白質相互作用，凸顯了此方法鑒定受到疾病影響的蛋白質復合物的潛力。

3 小結和展望

目前，CETSA技術與高分辨質譜技術相結合，已經成功應用于大腸桿菌、人類細胞、植物等多種生物體的研究，藥物靶標的發現及細胞內代謝物與蛋白質相互作用的研究。最新研究已將TPP法成功用于在體組織藥物靶標確證[30]。此外，TPP技術還用于植物溫度脅迫響應對蛋白質熱穩定性的影響，為解析植物熱響應開辟了新渠道[31]。廣義來說， MS-CETSA技術為從細胞蛋白質組學水平研究外界及內部因素對細胞或組織的擾動提供了新的機會,但還面臨以下挑戰：(1)蛋白質覆蓋率。目前CETSA技術適用于細胞中可溶性蛋白質的相互作用研究，但不適用于細胞膜上的水不溶性蛋白質。盡管加入NP-40或十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)能夠提高膜蛋白質的溶解度，但其對蛋白質的活性及藥物響應性的影響有待進一步研究。因此，采用合適的裂解液或者載體來提高細胞蛋白質與藥物的反應率及檢出率是亟待解決的問題之一。(2)熱鄰近共聚合的影響。細胞中存在多種蛋白質復合物，其由多個亞基組成，這些亞基具有熱鄰近共聚合現象。一個蛋白質復合物中有一個最不耐熱的亞基，當配體與該亞基結合后變得熱穩定，從而導致其他與之聚合的亞基也變得熱穩定，產生熱遷移，增加了假陽性的發生率。目前采用多維度MS-CETSA方法，有助于發現熱鄰近共聚合現象，提高蛋白質靶標檢測的靈敏度和靶標準確性。綜上所述，CETSA技術與多種檢測分析技術相結合，有助于高通量鑒定藥物的靶標蛋白，以及實現化合物靶標及脫靶效應研究的無偏見性。