血漿和腹膜透析液中萬古霉素濃度的測定及在腹膜透析相關性腹膜炎患者中的應用

方 玲，吳依繁，程光敏，徐星銘，趙 珉，夏 泉*

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，合肥 230022；2.國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，合肥 230022；3.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230012； 4.安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科，合肥 230022)

腹膜透析是終末期腎臟病一種有效的替代療法，而各種感染導致的腹膜透析相關性腹膜炎是其常見的并發癥，也是患者終止腹膜透析治療的主要原因[1]，腹膜炎治療推薦萬古霉素和第三代頭孢菌素聯合腹腔給藥[2-3]。萬古霉素的治療效果與其在體液中的谷濃度密切相關，而腎功能不全患者個體間的藥物谷濃度差異較大[4]。但由于殘余腎功能的影響，腹腔應用萬古霉素后，不同患者的藥物排泄速率有明顯差異，因此需監測血漿和腹膜透析液中萬古霉素的濃度，并根據監測結果調整藥物劑量。本研究建立了高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法同時測定血漿和腹膜透析液中萬古霉素的濃度，并應用于腹膜透析相關性腹膜炎患者的樣品測定，以期為臨床個體化用藥提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 安捷倫1260液相色譜分析儀(美國安捷倫公司)；KDC-1044低速離心機、HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；超聲波清洗機(賽飛中國有限公司)；SHB-Ⅲ循環水真空泵(鄭州長城科工貿公司)；FA2004電子天平(精度十萬分之一，德國Mettler Toledo公司)；渦旋儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.2 藥品和試劑 萬古霉素對照品(純度98%，批號130360-201302)和去甲萬古霉素對照品(純度87.7%，批號130338-201704)由中國食品藥品檢定研究院提供；磷酸二氫鉀(KH2PO4，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，瑞典歐普森色譜試劑公司)；高氯酸(分析純，上海潤捷化學試劑有限公司)；磷酸(分析純，上海蘇懿化學試劑有限公司)。

2 方 法

2.1 對照品溶液和內標溶液的配制 (1)對照品溶液：精密稱取萬古霉素對照品10.00 mg，置10 ml容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，配制成1.00 mg/ml的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液10、20、50、100、200、400、600、800、1000、2000 μl，置于5 ml容量瓶中，用超純水定容，配制成濃度為2、4、10、20、40、80、120、160、200、400 μg/ml的萬古霉素對照品溶液。(2)內標溶液：精密稱取去甲萬古霉素對照品5.00 mg，置20 ml量瓶中，用超純水稀釋并定容，配制成濃度為0.25 mg/ml的內標溶液A，精密量取600 μl內標溶液A，置于5 ml容量瓶中，用超純水稀釋成濃度為0.12 mg/ml的內標溶液B。

2.2 血漿樣品和腹膜透析液樣品的預處理 采集靜脈血和腹膜透析液樣品各3 ml，置EDTA抗凝管中，以相對離心力1.861×103×g離心10 min，分別精密吸取血漿和腹膜透析液各200 μl，置于1.5 ml離心管中，血漿樣品加內標溶液A，腹膜透析液樣品加內標溶液B，加入200 μl的10%高氯酸∶乙腈(6∶1)，渦旋混勻，以相對離心力1.2×104×g離心10 min，分別取10 μl上清液進樣分析。

2.3 色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇∶乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4(11∶2∶87)；檢測波長236 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μl。

2.4 專屬性實驗 分別取空白樣品、空白樣品+去甲萬古霉素內標溶液A、空白樣品+萬古霉素對照品溶液、血漿樣品+去甲萬古霉素內標溶液A、腹膜透析液樣品+去甲萬古霉素內標溶液B，按2.2項下方法做預處理，按2.3項下色譜條件進樣分析。

2.5 標準曲線的建立 (1)血漿樣品：取7份空白血漿160 μl，加入20 μl內標溶液A，分別加入濃度為2、4、20、40、120、200、400 μg/ml的萬古霉素對照品溶液20 μl，配制成系列濃度為0.2、0.4、2、4、12、20、40 μg/ml的血漿樣品，預處理后進樣分析。(2)腹膜透析液樣品：取7份空白腹膜透析液160 μl，加入20 μl的內標溶液B，分別加入濃度為2、4、10、20、40、80、160 μg/ml的萬古霉素對照品溶液20 μl，配制成系列濃度為0.2、0.4、1、2、4、8、16 μg/ml的腹膜透析液樣品，預處理后進樣分析。

2.6 精密度實驗 精密吸取萬古霉素對照品溶液和內標溶液，加入空白血漿或空白腹膜透析液配制成4種濃度的萬古霉素混合樣品，包括定量限、低濃度、中濃度、高濃度，具體如下。(1)血漿樣品：萬古霉素濃度為0.2、0.4、20、32 μg/ml，去甲萬古霉素為25 μg/ml；(2)腹膜透析液樣品：萬古霉素濃度為0.2、0.4、8、12 μg/ml，去甲萬古霉素為12 μg/ml。預處理后進樣分析，計算日內精密度。每個濃度平行配制5份，連續測定3 d，計算日間精密度。

2.7 回收率實驗 采用2.6項下方法分別配制4種濃度的萬古霉素血漿和腹膜透析液樣品，預處理后進樣分析，得到萬古霉素峰面積，同時將對照品和內標溶液加適量水稀釋后，配置成萬古霉素和去甲萬古霉素終濃度與上述血漿和腹膜透析液濃度一致的水溶液樣品，進樣分析，得到萬古霉素峰面積，計算提取回收率和方法回收率。提取回收率=(血漿或腹膜透析液樣品萬古霉素峰面積/水溶液樣品萬古霉素峰面積)×100%，方法回收率=(實測濃度/標示濃度)×100%。

2.8 穩定性實驗 配制低、中、高濃度的萬古霉素樣品，各濃度平行12份，分為4組：即刻預處理、室溫放置6 h、4 ℃保存24 h、-20 ℃反復凍融3次，每組各3份，預處理后進樣分析。

2.9 病例收集和處理 體液樣本由安徽醫科大學第一附屬醫院腎內科腹膜透析患者提供，其中空白血漿和腹膜透析液來自未使用萬古霉素的患者，含藥血漿和腹膜透析液來自腹腔應用萬古霉素的患者。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，所有患者均簽訂書面知情同意書。收集診斷為腹膜透析相關性腹膜炎患者，給予萬古霉素2.0 g，每5 d用藥1次，腹腔給藥并保留6 h；第二次給藥前30 min采靜脈血和腹膜透析液各3 ml。病例排除標準：(1)入院前已使用過萬古霉素者；(2)非腹腔途徑給予萬古霉素者；(3)主動要求退出試驗者。出現以上任一項即排除。

3 結 果

3.1 專屬性實驗 血漿和腹膜透析液的HPLC譜圖見圖1和圖2。由圖1和圖2可見，血漿和腹膜透析液中的內源性物質對萬古霉素的測定無干擾，內標與待測物分離度良好。

3.2 標準曲線 以萬古霉素濃度 (c) 為x軸，萬古霉素與去甲萬古霉素峰面積的比值為y軸，采用加權(1/x2)最小二乘法線性回歸。(1)血漿樣品：標準曲線方程為y=0.100 3x+0.303 7(r=0.998 0，n=7)，在0.2～40 μg/ml濃度范圍內線性關系良好，定量限為0.2 μg/ml，準確度為(88.53±2.45)%。(2)腹膜透析液樣品：標準曲線方程為y=0.278 9x+0.166 8(r=0.999 6，n=7)，在0.2～16 μg/ml濃度范圍內呈良好線性關系，定量限為0.2 μg/ml，準確度為(90.21±2.62)%。

圖1 血漿樣品的HPLC譜圖

圖2 腹膜透析液樣品的HPLC譜圖

3.3 回收率實驗結果 檢測定量限、低濃度、中濃度、高濃度的萬古霉素混合樣品中萬古霉素濃度，計算血漿和腹膜透析液的提取回收率均>85%，方法回收率>85%，結果見表1。

表1 血漿和腹膜透析液中萬古霉素的回收率和精密度實驗結果

3.4 精密度實驗結果 檢測定量限、低濃度、中濃度、高濃度的萬古霉素混合樣品的日內、日間精密度，結果顯示低、中、高濃度樣品的RSD均<15%，定量限(0.2 μg/ml)的日內、日間RSD<20%。結果見表2。

3.5 穩定性實驗結果 血漿和腹膜透析液樣品分別在室溫放置6 h、4 ℃放置24 h，測定萬古霉素穩定性RSD均在1.82%～6.38%范圍內，穩定性良好，結果見表2和表3。但低濃度(0.4 μg/ml)萬古霉素血漿樣品和腹膜透析液樣品反復凍融3次，穩定性RSD>15%，血漿樣品反復凍融前2次RSD分別為6.52%、12.89%；腹膜透析液樣品反復凍融前2次RSD分別為3.90%、12.06%。推薦血漿樣品和腹膜透析液樣品凍融不超過2次，或在室溫放置6 h、4 ℃放置24 h內完成萬古霉素濃度測定。

3.6 腹膜炎患者血漿和腹膜透析液中萬古霉素濃度的測定 共納入36例患者，其中男性15例，女性21例；年齡30～61歲，平均年齡(49.42±11.10)歲；透析治療時長0.1～8.0年，平均治療時長(3.09±3.03)年；患者的萬古霉素血漿濃度10.02～23.43 μg/ml，平均血漿濃度(17.98±2.93) μg/ml；腹膜透析液中萬古霉素濃度3.51～15.70 μg/ml，平均濃度(8.15±3.03) μg/ml。有31例患者的萬古霉素達到有效治療濃度(即血漿濃度≥15 μg/ml且腹膜透析液濃度≥4 μg/ml)，另外5例患者的血漿中藥物濃度<15 μg/ml或腹膜透析液中藥物濃度<4 μg/ml。萬古霉素主要經腎臟排泄，腹膜透析患者的腎功能殘余量影響藥物的濃度，這5例萬古霉素濃度不達標的患者尿量均>500 ml/d。之后，根據尿量將患者分為3組：<100 ml/d組、100～500 ml/d組、>500 ml/d組。結果顯示，尿量<100 ml/d組患者的血漿和腹膜透析液中藥物濃度均達到有效治療濃度，達標率100%；100～500 ml/d組患者的藥物濃度達標率為86.67%，與<100 ml/d組相比，兩組患者血漿和腹膜透析液中的藥物濃度無顯著性差異(P>0.05)。 但尿量>500 ml/d組患者血漿和腹膜透析液中的萬古霉素濃度均顯著低于前兩組(P<0.05)。各組患者血漿和腹膜透析液中萬古霉素濃度測定結果見表4。

表2 血漿樣品中萬古霉素的穩定性實驗結果

表3 腹膜透析液中萬古霉素的穩定性實驗結果

表4 腹膜炎患者血漿和腹膜透析液中萬古霉素濃度測定結果

4 討 論

本研究前期選用甲醇∶乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶2∶85)作為流動相，萬古霉素出峰時間為11.66 min，且與腹膜透析液內源性物質和內標峰分離良好，但血漿中雜質峰與內標峰分離度較差，作者認為這與腹膜透析液、血漿成分差異有關。經腹膜透析治療交換后的腹膜透析液的成分主要包括水、葡萄糖、蛋白質、鉀、肌酐等[5]；而血漿成分較為復雜，包括蛋白質、脂類、無機鹽、糖、氨基酸、藥物以及藥物代謝物。此外，許多腹膜透析患者同時患有多種慢性疾病，服用藥物種類繁多，如抗高血壓藥、降糖藥、糾正貧血藥物、改善鈣磷代謝藥物等，這也增加了血漿樣品測定的雜質峰。通過多次調整，最終確定流動相比例為甲醇∶乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4=11∶2∶87，萬古霉素保留時間為17.73～18.63 min，萬古霉素、內標與血液或腹膜透析液中內源性成分分離度良好。

關于內標物的選擇，曾有文獻報道以甲硝唑[6]、替硝唑[7]作為內標，測定生物樣品中萬古霉素的濃度，但臨床常有上述藥物聯用的情況，這會影響測定結果。去甲萬古霉素與萬古霉素的結構、活性相似，但毒性較萬古霉素大，臨床上已較少使用，更不可能將兩者合并使用，故本研究選擇去甲萬古霉素作為內標。

國際腹膜透析協會制訂的《腹膜透析相關性腹膜炎指南(2016版)》[3]和《中國萬古霉素治療藥物監測指南》均建議，腹膜炎患者的萬古霉素血藥濃度維持在15 μg/ml以上，但這兩個指南均沒有明確推薦腹膜透析液中的萬古霉素濃度。本院腹膜炎患者腹膜透析液培養G+菌的藥敏試驗結果顯示，萬古霉素最低抑菌濃度<4 μg/ml[8]，因此本研究設定腹膜透析液中萬古霉素目標濃度為4 μg/ml。腹膜炎患者腹腔給予2.0 g萬古霉素，每5 d給藥一次，在第2次給藥前抽取血液和腹膜透析液測定萬古霉素濃度(即谷濃度)，結果發現31例(86.11%)患者的濃度達標，這高于國內其他文獻報道的達標率[9]。僅5例患者的血漿藥物濃度<15 μg/ml或腹膜透析液中藥物濃度<4 μg/ml，可能與該5例患者的尿量較多有關，其中3例患者的尿量>1000 ml/d。根據尿量分組，發現尿量>500 ml/d的患者血漿和腹膜透析液中萬古霉素濃度明顯低于100～500 ml/d組和<100 ml/d組。因此，有研究者推薦對于有尿的腹透患者，萬古霉素的劑量可增加25%[10]，并根據藥物濃度監測結果進一步調整劑量。

本研究還存在一些局限性。由于納入的病例數有限，且腹膜透析液病原菌培養出G+菌的僅17例，因此本研究僅對藥物濃度進行分析，并未做療效評價，課題組后續將擴大臨床樣本量，進一步分析濃度與療效的相關性。綜上所述，本研究建立的HPLC法可同時測定血漿和腹膜透析液中萬古霉素濃度，滿足腹膜炎患者的治療藥物監測的需求。本研究檢測了36例腹膜炎患者的血漿和腹膜透析液中萬古霉素濃度，大部分患者的藥物濃度達標，但有尿患者的藥物濃度偏低。建議對尿量>500 ml/d的患者適當增加萬古霉素劑量，加強濃度監測，以維持有效治療濃度，提高治療效果，減少藥品不良反應的發生。