黃 彪，蔡方超，趙 鑫，曹永兵，周婷婷，范國榮*

[1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海 200433；2.科文斯醫(yī)藥研發(fā)(上海)有限公司生物分析部，上海 201203]

紅景天主要生長于海拔約4000米的巖石或冰川中，因此被譽為“高原人參”。目前的研究結(jié)果顯示，紅景天及其活性成分在抗疲勞，抗氧化，保護心血管、肝腎功能及抗癌，抗抑郁方面均有很好的功效，有增強機體機能和提高免疫力等作用[1-3]。近年來,對于紅景天苷的國內(nèi)外研究多集中于其功效方面，體內(nèi)藥物含量測定多以大鼠為研究對象[4-6]。在測定比格犬體內(nèi)紅景天苷和酪醇含量的研究報道中，未見對其生物利用度的考察，且檢測方法靈敏度較低[7-8]，不足以支持其體內(nèi)藥動學(xué)研究。

本研究建立了準(zhǔn)確、靈敏、高效的LC-MS/MS法，用于測定比格犬血漿中紅景天苷及其主要代謝物酪醇的含量。血漿樣品預(yù)處理在常規(guī)萃取溶劑氯仿中添加苯酚(除蛋白質(zhì))和異戊醇(促進苯酚和氯仿互溶)，使得一步萃取能同時達到蛋白質(zhì)沉淀和液-液萃取的目的，為藥物臨床審批和后續(xù)臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 Triple quad 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Shimadzu LC30島津液相色譜系統(tǒng)(日本島津儀器有限公司);Elma sonic P 300H超聲波清洗器(德國埃爾瑪公司)；XPR6UD5和XPE205型高精準(zhǔn)度電子天平(精度0.5 μg，瑞士梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司)。

1.2 藥品和試劑 紅景天苷對照品(純度99.0%，批號20180901)由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室提供；酪醇對照品(純度98.0%，批號A1015AS)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；天麻素對照品(純度98.9%，批號14031921)購自上海同田生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；氨水、氯仿、苯酚和異戊醇等其他試劑均為分析純；超純水(本教研室用MilliQ純水儀自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 選擇Shimadzu Shim-pack Velox PFPP色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以水(A相)含20%乙腈的甲醇溶液(B相)為流動相梯度洗脫(0～1 min,12%B;1～2.5 min,12%～85%B;2.5～3.5 min,85%B;3.5～3.6 min,85%～12%B;3.6～5 min,12%B)，流速0.3 ml/min；柱溫40 ℃；自動進樣器溫度為5 ℃；進樣量為2 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子(ESI)源，負(fù)離子模式檢測；源噴射電壓為-4500 V；去溶劑溫度為550 ℃；霧化器(GS1)和輔助加熱氣(GS2)分別為75 psi(1 psi=6.894 76 Pa)和60 psi；氣簾氣體模式的壓力為35 psi；入口電壓(EP)為10 V；碰撞室出口電壓(CXP)為14 V；掃描方式選擇多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，掃描時長為100 ms。離子監(jiān)測通道分別為m/z299.1→118.9(紅景天苷)、m/z137.0→105.9(酪醇)和m/z285.1→122.9(內(nèi)標(biāo)天麻素)。紅景天苷、酪醇和天麻素的去簇電壓分別為-70 eV、-100 eV和-40 eV，碰撞能量分別為-19 eV、-22 eV和-17 eV。

2.2 溶液的配制 分別精密稱取紅景天苷和酪醇對照品各兩份，溶解于40%乙腈溶液，定容，得到濃度均為0.4 mg/ml的紅景天苷及酪醇儲備液。用40%乙腈溶液稀釋紅景天苷及酪醇儲備液，得紅景天苷和酪醇濃度分別為0.2、0.4、2、8、32、80、180、200 μg/ml和0.02、0.04、0.2、0.8、3.2、8、18、20 μg/ml的系列對照品工作液； 紅景天苷和酪醇的濃度分別為0.2、0.6、10、160 μg/ml和0.02、0.06、1、16 μg/ml的質(zhì)控樣品工作液， 于4 ℃保存， 備用。

另外，精密稱取天麻素對照品一份，溶解于40%乙腈溶液，定容，得濃度為0.1 mg/ml的天麻素對照品儲備液。用水稀釋得濃度為500 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃保存，備用。

2.3 溶血血漿的配制 將新鮮采集的比格犬空白全血放入-70 ℃冰箱冷凍后，經(jīng)至少一次凍融循環(huán)，渦旋3 min，3.5×103×g離心5 min，取上層溶血血漿和常規(guī)血漿按照體積比2∶98進行混合，渦旋1 min，制得溶血血漿，于-20 ℃冰箱保存，備用。

2.4 血漿樣品的處理 血漿樣品預(yù)處理選用的液-液萃取溶劑為氯仿、苯酚和異戊醇的混合試劑(體積比為50∶48∶2)。取50 μl比格犬血漿樣品，依次加入50 μl內(nèi)標(biāo)工作液和100 μl濃氨水(28%～32%)，渦旋混合2 min后，超聲5 min。加入300 μl萃取溶劑，渦旋3 min，3.5×103×g離心5 min，加水250 μl，再次渦旋3 min，離心15 min，取上清液300 μl，55 ℃下氮氣吹干，加入150 μl復(fù)溶液(乙腈∶甲醇∶水=2∶8∶90，V∶V)，渦旋后以相對離心力3.5×103×g離心5 min，取2 μl進行LC-MS/MS分析。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 專屬性 分別取6份不同來源的比格犬空白血漿樣品和用此6份空白血漿配制而成的定量下限(LLOQ)質(zhì)控樣品，評估不同來源的空白血漿中內(nèi)源性干擾問題。分別取若干份比格犬空白血漿，按照2.4項下方法進行處理，再按2.1項下色譜和質(zhì)譜條件進行測定。結(jié)果表明，在本研究設(shè)定的條件下，內(nèi)源性物質(zhì)對紅景天苷、酪醇和內(nèi)標(biāo)天麻素的測定不產(chǎn)生干擾。紅景天苷、酪醇、天麻素的出峰時間分別為2.3、2.6、1.5 min，典型圖譜見圖1。

圖1 紅景天苷和酪醇的LC-MS/MS譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測限 取950 μl比格犬空白血漿樣品，分別加入50 μl對應(yīng)濃度的紅景天苷及酪醇標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液，得到紅景天苷和酪醇濃度分別為10.0、20.0、100、400、1 600、4 000、9 000、10 000 ng/ml和1.00、2.00、10.0、40.0、160、400、900、1 000 ng/ml的系列對照血漿樣品，按2.4項下方法處理后進行LC-MS/MS分析。將待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)作為縱坐標(biāo)，對應(yīng)待測濃度(x，ng/ml)作為橫坐標(biāo)進行線性回歸(加權(quán)相關(guān)系數(shù)為1/x2)，擬合得標(biāo)準(zhǔn)定量曲線。結(jié)果紅景天苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.005 89x+0.025 4(r=0.996 3)；酪醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.002 13x+0.003 84(r=0.998 3)，表明紅景天苷和酪醇分別在10～10 000 ng/ml和1～10 000 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。紅景天苷和酪醇的LLOQ分別為10和1 ng/ml[信噪比(S/N)≥10]，最低檢測限(LOD)分別為1和0.3 ng/ml(S/N≥3)。

2.5.3 精密度和提取回收率 采用比格犬空白血漿配制LLOQ及低、中、高濃度的紅景天苷和酪醇血漿質(zhì)控樣品，每個濃度配制6份樣品，隨行配制并測定樣品，連續(xù)3 d，計算質(zhì)控樣品的測得濃度，以獲得本法的批內(nèi)(日內(nèi))、批間(日間)精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 紅景天苷和酪醇測定的精密度和準(zhǔn)確度

用比格犬空白血漿配制低、中、高濃度的血漿樣品，按2.4項下方法操作，每個濃度進行6份樣品分析。同時吸取比格犬空白血漿50 μl，不加內(nèi)標(biāo)溶液(用50 μl純水替代內(nèi)標(biāo)溶液)，其余按2.4項下方法操作，測定峰面積。用提取后待測物色譜峰的峰面積與未經(jīng)樣品預(yù)處理的待測物色譜峰的峰面積比值來計算方法的提取回收率。結(jié)果低、中、高濃度紅景天苷的提取回收率分別為91.0%、97.3%和103.6%(n=6)；低、中、高濃度酪醇的提取回收率分別為96.2%、97.5%和100.6%(n=6)。可見精密度及回收率的測定結(jié)果符合現(xiàn)行生物分析方法的相關(guān)規(guī)定，可應(yīng)用于比格犬血漿中紅景天苷和酪醇的定量分析。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 取6份不同來源的比格犬空白血漿和1份空白溶血血漿(50 μl)，用50 μl純水替代內(nèi)標(biāo)工作溶液，按2.4項下操作至氮氣吹干，分別添加標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液，使其濃度和低、高濃度質(zhì)控樣品相同，獲取其峰面積(A)，并與相應(yīng)濃度純?nèi)芤悍迕娣e(B)比較，計算基質(zhì)效應(yīng)(MF)。在同一濃度下，基質(zhì)效應(yīng)計算公式為A/B×100%。同時也對內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)(分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)比值)進行了評估。結(jié)果在比格犬正常血漿樣品中，紅景天苷低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為94.9%和97.4%，RSD分別為6.9%和2.4%(n=6)；酪醇低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為103.4%和95.2%，RSD分別為5.2%和3.0%(n=6)；內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為99.9%，RSD為3.2%(n=12)。在比格犬溶血血漿樣品中，紅景天苷低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為96.2%和99.4%，RSD分別為8.1%和5.3%(n=6)；酪醇低、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為103.5%和98.0%，RSD分別為5.3%和4.4%(n=6)；內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為92.6%，RSD為7.3%(n=12)。結(jié)果表明，在本研究操作條件下，常規(guī)血漿以及溶血血漿中，待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。

2.5.5 穩(wěn)定性 考察紅景天苷和酪醇儲備液和工作液室溫放置6 h，比格犬血漿樣品在室溫條件下放置24 h，全血質(zhì)控樣品分別于濕冰或室溫條件下放置2 h、經(jīng)液-液萃取處理后于自動進樣器放置96 h，比格犬血漿樣品分別于-20 ℃和-70 ℃經(jīng)歷5次冷凍-解凍循環(huán)，比格犬血漿樣品于-20 ℃和-70 ℃冷凍35 d的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，紅景天苷和酪醇在上述考察條件中的穩(wěn)定性均符合生物樣品的檢測要求。

2.5.6 稀釋效應(yīng) 考察超出定量上限的質(zhì)控樣品經(jīng)空白血漿稀釋后的準(zhǔn)確度。取紅景天苷及酪醇的稀釋質(zhì)控樣品(質(zhì)量濃度分別為8 000、80 000 ng/ml)，用空白比格犬血漿將其體積稀釋20倍，按2.4項下操作，進行6個樣本平行分析。結(jié)果表明，經(jīng)空白比格犬血漿稀釋后的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度良好。

2.6 藥動學(xué)研究 動物實驗在上海新岡實驗動物場進行[實驗動物許可證號：SCXK(滬)2017-0006]。比格犬體質(zhì)量為6～8 kg，24～30周齡，雌雄各半。禁食(自由飲水)12 h后給藥，給藥4 h后允許進食。

比格犬口服給藥組(n=6，雌雄各半)紅景天苷給藥劑量為15 mg/kg，口服膠囊1粒，飲用水送服。膠囊裝藥量根據(jù)比格犬實際體質(zhì)量計算，即膠囊裝藥量(mg)=體質(zhì)量(kg)×給藥劑量(15 mg/kg)。于給藥前0.5 h內(nèi)采集空白血漿，給藥后即刻，15、30、45 min，1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、16、24 h經(jīng)前肢靜脈取血1 ml，置于肝素鈉抗凝試管中，2.5×103×g(4 ℃)離心10 min分離血漿，于-70 ℃儲存，待測。

比格犬靜脈注射給藥組(n=6，雌雄各半)紅景天苷給藥劑量為1.5 mg/kg。注射液用生理鹽水配制，統(tǒng)一于左前肢靜脈推注給藥1 ml，注射液濃度根據(jù)比格犬實際體質(zhì)量進行計算，即注射液濃度(mg/ml)=體質(zhì)量(kg)×給藥劑量(1.5 mg/kg)/注射液體積(1 ml)。分別于給藥前0.5 h內(nèi)，給藥后即刻，2、5、10、20、30、45 min，1、1.5、2、3、4、6、8、12 h經(jīng)右前肢靜脈取血1 ml，置于肝素鈉抗凝試管中，2.5×103×g(4 ℃)離心10 min，分離血漿，于-70 ℃儲存，待測。

采用Phoenix WinNonlinR 8.1軟件(美國Pharsight公司)以非房室模型進行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果統(tǒng)計分析，并繪制其血藥濃度-時間曲線。比格犬單劑量口服和靜脈注射紅景天苷后體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)見表2，平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

2.7 絕對生物利用度 經(jīng)考察，紅景天苷和酪醇在比格犬中的絕對生物利用度不同性別間不存在顯著差異。劑量歸一化后，紅景天苷和酪醇的絕對生物利用度分別為33.5%和48.8%。

3 討 論

目前對紅景天苷的藥動學(xué)研究主要集中在大鼠身上，僅有少量在比格犬中的研究，且主要代謝物酪醇鮮有文獻報道。以往的研究中，未見《中華人民共和國藥典》中針對生物分析方法驗證所要求的特殊基質(zhì)(溶血血漿、高脂血等)基質(zhì)效應(yīng)的考察。因高脂血研究不適用于比格犬，故本研究僅新增紅景天苷和酪醇在溶血血漿中的基質(zhì)效應(yīng)考察。在用LC-MS/MS法檢測紅景天苷濃度時，常規(guī)方法中溶血血漿在提取后嚴(yán)重抑制了紅景天苷和酪醇的響應(yīng)，使其無法準(zhǔn)確定量。本研究采用氯仿、 苯酚和異戊醇混合試劑進行液-液萃取的同時，血漿中蛋白質(zhì)成分也被同時去除，減少了基質(zhì)對定量測定的影響，解決了在溶血血漿中定量不準(zhǔn)確的問題。通過選擇合理的色譜柱和梯度洗脫條件，減少了質(zhì)譜背景干擾對檢測限的影響，提高了分析方法的的靈敏度(酪醇最低定量限為1 ng/ml)和分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度。

表2 比格犬在單次給藥(口服15 mg/kg或靜脈注射1.5 mg/kg)后的主要藥動學(xué)參數(shù)

圖2 紅景天苷和酪醇的平均血藥濃度-時間曲線

本研究建立的分析方法嚴(yán)格遵守了2020年版《中華人民共和國藥典》四部中生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則[9]，為研究紅景天苷及其代謝物酪醇在比格犬中的藥動學(xué)提供了技術(shù)參考，為進一步臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

致謝感謝科文斯醫(yī)藥研發(fā)(上海)有限公司提供分析儀器和檢測場地！