直腸癌患者伊立替康化療敏感性與拓撲異構酶1水平的關系

徐 佳，蔡東焱，劉曉媛，顧 盼，陳 楊，周少丹*

(1.江南大學附屬醫院藥學部，江蘇無錫 214121；2.江南大學附屬醫院腫瘤內科，江蘇無錫 214121)

目前，外科手術是治療直腸癌的常用方式，以手術為主的治療方式5年生存率可達50%～80%，然而部分患者術后可能發生復發、遠處轉移等不良事件[1]。對于晚期直腸癌患者，臨床通常建議通過化療改善病情，延長生存期，但因存在個體差異，不同病例對化療藥物的敏感性也有差異[2]。含伊立替康的FOLFIRI方案是目前結直腸癌主要的化療方案之一，可將晚期結直腸癌患者的生存時間延長至30個月[3]。拓撲異構酶1(topoisomerase 1,TOPO-1)對維持生物體運行有重要作用，可調節DNA修復、轉錄、復制等過程。研究指出，TOPO-1可引起惡性腫瘤DNA長鏈斷裂和再修復，引發DNA出現不可逆損傷，最終引發腫瘤細胞死亡[4]。伊立替康屬于喜樹堿半合成衍生物，對TOPO-1有抑制作用，從而將DNA單鏈斷裂后阻斷修復途徑[5]。本研究旨在觀察直腸癌患者伊立替康化療敏感性與TOPO-1水平的關系，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 納入江南大學附屬醫院2017年1月-2019年6月收治的直腸癌患者80例，所有患者均接受以伊立替康為主的化療方案。其中男性43例，女性37例，年齡42～79歲，平均年齡(65.39±9.64)歲；臨床分期：Ⅲ期48例，Ⅳ期32例；分化程度：低分化41例，中/高分化39例；腫瘤類型：原發性51例，轉移性29例；病理類型：管狀腺癌30例，乳頭狀腺癌27例，黏液腺癌12例，印戒細胞癌11例。

1.2 納入標準和排除標準

1.2.1 納入標準 (1)化療前行內鏡下活檢，病理診斷為直腸癌；(2)接受以伊立替康為主的化療方案；(3)入院前未接受過其他化療、放療；(4)至少有1個可測量病灶；(5)具有簽署知情同意書的能力。

1.2.2 排除標準 (1)患有其他原發性腫瘤；(2)預計生存期不超過3個月；(3)對本次化療方案不耐受；(4)未采集到合格的病理組織用于檢測。

1.3 TOPO-1水平的檢測 所有納入患者于入院后第2天，經免疫組化法測定TOPO-1在病灶組織中的表達水平。(1)蠟切片方法：①行腸鏡活檢，取病理組織，經福爾馬林固定液(濃度為10%)固定，促進細胞和組織中蛋白質變性、凝固。②針對組織塊行脫水處理，脫去殘余水分，置于二甲苯內脫乙醇。③取組織塊浸泡于石蠟內，然后存放于融蠟箱中，經包埋處理后，取石蠟液置于器皿內，冷卻，凝固。④取包埋組織，置于切片機，切成厚度約5 μm的薄片，然后將切片置于攤片機燙平，使薄片盡量貼于載玻片，在45 ℃恒溫箱中進行干燥。⑤將干燥的切片依次置入從高至低濃度的酒精，最后放入蒸餾水，將石蠟成分脫去，清洗組織切片，行染色處理。(2)免疫組化法：①取石蠟切片，在溫度為70 ℃的烤箱烤2 h，脫蠟。②用酒精脫吐溫，經自來水清洗5 min。③行修復抗原，時間為3 min，用濃度為3%的H2O2去離子水進行孵育，時間為10 min，經磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次2 min。④滴入TBST沖洗液，各玻片加入30 μl。⑤用PBS沖洗3次，每次2 min，加入1滴一抗，振蕩玻片，將組織抗原與加入液體充分混合，在37 ℃恒溫箱中反應4 h。⑥各玻片取TBST沖洗液30 μl進行沖洗，加入二抗，振蕩，在37 ℃恒溫箱中反應20 min。⑦用TBST沖洗液清洗兩次，每次2 min，用TBST沖洗液浸泡3次，每次2 min。⑧行DAB顯色，時間為3 min。行蘇木素復染，分解染色，烘干，封片。在顯微鏡下進行觀察，取5～10個高倍視野，計算陽性染色腫瘤細胞的占比。

1.4 血樣采集和測定 觀察患者化療8個周期后的近期療效，將治療無效者視為伊立替康化療不敏感，將治療有效者視為伊立替康化療敏感，分為敏感組和不敏感組，比較兩組患者的TOPO-1水平。分別在患者入院時、化療8個周期后，空腹狀態下采集2 ml靜脈血，2000 r/min離心10 min，分離血清，經化學發光免疫法測定血清糖類抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)水平，比較兩組患者的血清指標。

1.5 化療方案 患者均接受以伊立替康為主的化療方案。其中有48例行伊立替康+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣化療方案，180 mg/m2伊立替康(100 mg/瓶，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，靜脈滴注，第1天；400 mg/m2亞葉酸鈣[10 ml∶0.1 g(以亞葉酸計)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司]，靜脈滴注，第1天；400 mg/m2氟尿嘧啶，靜脈推注，第1天；2400 mg/m2氟尿嘧啶(10 ml∶0.25 g，天津金耀藥業有限公司)，持續靜脈滴注46～48 h，每隔2周重復1次，干預8個周期后評價療效。有32例患者行伊立替康+卡培他濱方案化療，200 mg/m2伊立替康，靜脈滴注，第1天；1000 mg/m2卡培他濱(0.5 g/片，上海羅氏制藥有限公司)，口服，bid，第1～14天；每隔3周重復1次。

1.6 療效評價[6]完全緩解：病灶完全消除；部分緩解：病灶縮小幅度≥30%；穩定：病灶縮小幅度<30%或增加幅度<20%；進展：病灶增加幅度≥20%或有新病灶生成。將干預后完全緩解或部分緩解患者納入敏感組，穩定或進展患者納入不敏感組。

2 結 果

2.1 兩組患者TOPO-1表達水平的比較 在80例患者中，有32例(40.00%)部分緩解，26例(32.50%)穩定，22例(27.50%)進展。將部分緩解患者納入敏感組(n=32)，將穩定和進展患者納入不敏感組(n=48)。敏感組患者的TOPO-1表達水平為(16.39±3.26)%，顯著高于不敏感組的(11.28±2.11)%(P<0.001)。

2.2 TOPO-1表達對伊立替康化療敏感性的評估價值分析 TOPO-1表達評估伊立替康化療敏感性的曲線下面積(AUC)為0.780(標準誤=0.054，P<0.001，95%CI:0.675～0.886)，最佳界值為14.34%，敏感度為71.40%，特異度為80.00%。ROC曲線見圖1。

圖1 TOPO-1表達評估伊立替康化療敏感性的ROC曲線

2.3 兩組患者CA19-9和CEA血清水平的比較 兩組患者治療前的CA19-9和CEA的血清水平比較無顯著性差異(P>0.05)，敏感組患者治療后的CA19-9和CEA的血清水平顯著低于治療前，與不敏感組治療后也有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者CA19-9和CEA血清水平的比較

2.4 TOPO-1表達水平與CA19-9、CEA血清水平的相關性 Pearson線性相關檢驗發現，TOPO-1水平與CA19-9、CEA血清水平呈正相關(r=0.817，P<0.001;r=0.701，P<0.001)。線性相關圖見圖2。

3 討 論

直腸癌是比較常見的消化道腫瘤，早期直腸癌患者經手術治療可獲得較理想治療效果，但部分患者就診時，病情已進入晚期，錯過最佳手術時機。直腸癌根治術后復發患者5年生存率為10%～68%[7]。研究顯示，伊立替康用于晚期結腸癌效果顯著，優于FOLFIRI治療方案[8]。與氟尿嘧啶相比，伊立替康對結直腸癌的療效更好，可提升總緩解率[9]。本研究表明，80例患者經含伊立替康的化療方案治療后，有32例患者對該藥敏感，總緩解率為32.50%，

但仍有48例患者對該藥敏感性欠佳。 因此，臨床需明確影響直腸癌患者伊立替康化療敏感性的機制，為治療提供依據。

圖2 TOPO-1表達水平與CA19-9、CEA血清水平的線性相關圖

TOPO-1被證實參與了DNA拓撲結構的調節過程，且其在多種生物體中均存在，如原核細胞、真核細胞等[10]。研究發現，在DNA復制過程中，雙螺旋打開，并形成單鏈，各單鏈互不交叉，在單鏈折疊、雙螺旋化過程中，TOPO-1發揮著重要作用，這表明TOPO-1可能是惡性腫瘤治療的一個作用靶點。另有研究提示，在乳腺癌、肺癌等腫瘤組織中，TOPO-1的含量均較高，且這類患者往往對TOPO-1抑制劑有更高敏感性[11-12]。本研究中，伊立替康敏感者的TOPO-1表達水平高于不敏感者，與上述文獻報道結果相符。伊立替康作為一種TOPO-1抑制劑，對TOPO-1表達具備良好的抑制作用[13]。該藥進入組織后，可通過羧酸酯酶作用，促進生成有活性的SN-38，形成中間產物，其抗腫瘤活性更強[14]。有研究發現，轉移性直腸癌患者的腫瘤組織中TOPO-1表達含量普遍較高，且TOPO-1高表達者對伊立替康的敏感性更好，主要原因在于高表達者的腫瘤細胞對該藥更敏感。因此，對于TOPO-1高表達者，伊立替康能夠使TOPO-1進一步被抑制[15]。本研究發現，患者經含伊立替康的化療方案治療后，不敏感者的CA19-9和CEA血清水平無明顯變化，而敏感者的CA19-9和CEA血清水平顯著下調，提示對伊立替康敏感的患者療效良好。經Pearson線性相關檢驗，發現TOPO-1水平與CA19-9、CEA血清水平有較強相關性。這表明腫瘤組織中TOPO-1水平越高，其CA19-9和CEA的血清水平也越高，間接提示直腸癌病灶組織中TOPO-1的表達情況能作為預測其療效的重要依據。

綜上，直腸癌患者采用含伊立替康的方案化療，敏感者的腫瘤組織中TOPO-1表達水平顯著高于不敏感者，且其表達水平與CA19-9、CEA的血清水平呈正相關，臨床醫師可將直腸癌組織中TOPO-1表達情況作為評價伊立替康療效的指標。然而，本研究也有局限性，如樣本量較小，未進行遠期隨訪，未來將增加樣本量，并觀察該化療方案在直腸癌患者中的遠期療效。