褪黑素對自然衰老大鼠腎臟保護作用的研究

李 露，劉曉茜，徐夢露，李莎莎，毛 迪，鄧連宇

(西安醫學院第一附屬醫院腎臟內科，西安 710077)

目前，全球范圍內人口老齡化問題愈加凸顯，隨之而來的老年相關疾病給人體健康以及社會經濟帶來極大威脅，老年性腎功能減退嚴重影響了老年人的健康和生活質量。自然衰老過程中的老年性退行性改變是一個多因素、多途徑的復雜的病理生理過程[1-2]，其發生涉及氧自由基的產生、細胞凋亡、血管內皮損傷、端粒酶活性降低等多種病理生理過程，機制復雜，尚未完全闡明[3-4]。近期有研究表明，老年性腎功能減退過程中也存在自噬，mTOR是細胞自噬的關鍵分子。褪黑素(melatonin)是松果體分泌的吲哚類內分泌激素，可通過降低氧化應激、調控自噬等在全身多種器官的保護中發揮重要作用，其作用機制尚不清楚[5]。本研究建立了自然衰老大鼠模型，旨在研究褪黑素能否通過mTOR信號通路調節自噬水平，從而減輕自然衰老過程中的腎臟損傷。

1 材料和方法

1.1 儀器和設備 光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；Western blot電泳儀及成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 動物和試劑 實驗動物為健康雄性8周齡SD大鼠40只，由空軍軍醫大學動物中心提供[許可證號：SYXK(陜)2019-001]。褪黑素(美國Sigma公司)；TUNEL試劑盒(美國Roche公司)；mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、LC3B(可標記出LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)、Beclin1、p62抗體(美國Sigma公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋公司)；小鼠肌酐(Cr)ELISA試劑盒(上海振譽生物科技有限公司)；尿素氮(UN)ELISA試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)。

1.3 自然衰老大鼠模型的建立及分組 將40只SD大鼠隨機分成4組：空白對照組(A組)、單純褪黑素處理組(褪黑素10 mg·kg-1·d-1，B組)、老年模型組(C組)和褪黑素干預老年模型組(褪黑素10 mg·kg-1·d-1，D組)。A組與B組大鼠用普通飼料飼養4周后取材，C組與D組大鼠以普通飼料飼養18個月后取材。給大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，在大鼠一側頸靜脈處剪開皮膚，逐層剝離皮下組織，找到頸靜脈，切開頸靜脈，采血2 ml后將大鼠處死。將靜脈血放置于離心機，以相對離心力1.2×104×g離心15 min，取上清液，-80 ℃冰凍備用。將大鼠開腹，暴露腎臟，于腎蒂處離斷，取雙側腎臟，用濾紙清潔表面血漬，切取部分腎臟組織置于4%多聚甲醛液中固定，剩余腎臟組織在-80 ℃冰凍保存備用。

1.4 腎臟組織形態HE染色 自然衰老大鼠模型建立成功后，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)把大鼠腎臟內血液沖洗干凈，將腎臟放入濃度為40 g/L的多聚甲醛中固定72 h，石蠟包埋、切片并進行HE染色。

1.5 血清肌酐(Scr)和尿素氮(UN)的檢測 大鼠模型建立成功后，將各組大鼠麻醉，取頸靜脈血置促凝管中，以相對離心力1.2×104×g離心15 min，吸取上清液(即血清)。依照試劑盒說明書，檢測各組大鼠的Scr和UN。

1.6 腎臟細胞凋亡的TUNEL染色檢測 分別取各組大鼠的腎臟組織，石蠟包埋、切片、脫蠟、復水后，按試劑盒說明書處理，以TUNEL法檢測細胞凋亡水平。用激光共聚焦顯微鏡采集切片成像，每張染色切片隨機選取10個高倍鏡視野，凋亡細胞核為綠色熒光，正常細胞核為藍色熒光，計算細胞凋亡指數(apoptotic index,AI)。AI=(凋亡細胞核數量/總細胞核數量)×100%。

1.7 腎臟組織Western blot檢測 切取100 mg大鼠腎臟組織，加入裂解液，低溫研磨裂解30 min，以相對離心力1.2×104×g在4 ℃離心20 min，取上清液。分別配置80、100和120 ml/L的分離膠進行電泳，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在室溫下用100 g/L牛奶封閉2 h，切取目的條帶，放入相應的β-actin(1∶5000)、p-mTOR(1∶1000)、mTOR(1∶1000)、p62(1∶1000)、Beclin1(1∶1000)、LC3B(1∶1000)的抗體溶液中，4 ℃孵育15 h，然后用TBST溶液洗膜5次，每次5 min，二抗室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜5次，每次5 min，顯色，以β-actin作為內參，分析灰度值。計算LC3B、Beclin1、p62和p-mTOR的表達。

1.8 腎臟組織切片LC3B免疫熒光檢測 將大鼠腎臟組織行常規石蠟包埋、切片、脫蠟后，用PBS清洗5次，每次6 min；用2 g/L的Triton-X 100覆蓋切片表面，室溫靜置15 min，以增加細胞膜通透性，用PBS洗5次，每次6 min；在室溫下用山羊血清封閉2 h，PBS洗5次，每次6 min；每張切片加LC3B抗體(1∶100)50 μl，4 ℃孵育15 h，PBS洗5次，每次6 min；避光條件下每張切片加熒光二抗(1∶500)50 μl，PBS洗3次，每次10 min；避光加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)溶液，PBS洗5次，每次6 min。用熒光防淬滅液封片，采集圖像。

2 結 果

2.1 腎臟組織HE染色 A組和B組大鼠的腎小球組織形態完整，排列有序，無纖維化，結構清晰；C組大鼠的腎小球萎縮，周圍可見組織纖維化，排列紊亂，細胞核大量逸出；D組大鼠的腎小球形態較C組更加飽滿、完整，纖維化程度減輕，排列雜亂的情況明顯得到改善(見圖1)。

2.2 各組大鼠Scr和UN水平的變化 與A組相比，B組大鼠的Scr和UN水平沒有明顯變化；C組大鼠的Scr和UN水平比A組明顯升高(P<0.05)；D組大鼠的Scr和UN水平比A組顯著增加，比C組顯著減少(P<0.05)，見表1。

2.3 腎臟細胞凋亡檢測 TUNEL染色提示，A組與B組大鼠腎臟組織染色沒有發現TUNEL陽性細胞核；C組比A組TUNEL陽性細胞核數量顯著增加，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；D組比C組的TUNEL陽性細胞核數量顯著減少，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖2。

表1 各組大鼠血清肌酐和尿素氮水平比較

2.4 各組大鼠腎臟組織自噬相關蛋白表達的變化 A組與B組大鼠自噬相關蛋白的表達明顯變化；與A組相比，C組的p-mTOR和Beclin1的表達水平顯著降低(P<0.05)，p62的表達水平明顯增高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(P<0.05)；D組大鼠的p-mTOR表達水平比C組明顯升高(P<0.05)，Beclin1的表達水平顯著升高(P<0.05)，p62的表達水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯增高(P<0.05)，見圖3。

2.5 各組大鼠腎臟組織LC3B表達的變化 A組和B組大鼠腎臟組織的LC3B免疫熒光染色無統計學差異；C組大鼠比A組大鼠的LC3B蛋白熒光染色數量明顯增高(P<0.05)；D組大鼠比C組大鼠的LC3B蛋白免疫熒光染色的數量明顯降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠腎臟組織LC3B免疫熒光染色

3 討 論

自噬過程是在饑餓、缺氧等外部刺激因素的影響下，自動消化自身細胞器的連續動態過程，主要是在溶酶體內對細胞內部受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質和侵入其內的病原體進行降解。自噬過程在細胞降解中具有高度保守的性質，存在于腫瘤、感染、免疫、應激等多種病理生理過程中。mTOR分子屬于磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)，是自噬重要的負調控因子。衰老過程也伴隨著各臟器自噬的變化，自噬的增強與減弱可能影響臟器的功能[6]。

褪黑素是松果體腺細胞以色氨酸合成的吲哚類物質，目前發現3種褪黑素受體。褪黑素與受體結合后，進入細胞內，發揮調節生物節律、血壓、延緩衰老進程、調節免疫及激素、影響生長發育等作用。以往研究提示，褪黑素有很好的腎臟系統保護作用[7]，且褪黑素能在全身各器官系統中發揮作用，但其具體機制仍在不斷的探索之中。褪黑素對自噬和內質網應激的作用已經在多種模型中進行了研究[8]。腎缺血再灌注損傷將導致多器官功能受損[9]。文獻報道，褪黑素在雄性大鼠缺血再灌注損傷后可維持腎臟超微結構的完整性，降低血清肌酐水平、尿蛋白與肌酐比值，減輕足細胞、腎臟、腎小球、腎小管損傷，維持腎小球完整性[10]。褪黑素的應用改善了缺血再灌注引起的線粒體氧化還原狀態、膜結構、動力學等，其對心肌細胞、大腦、腎臟、肺和肝自噬功能的調節作用值得深入研究。

隨著對自噬尤其是自噬調節的復雜信號通路研究不斷深入，靶向自噬調控成為治療疾病的有效手段。對于許多已經報道的可調節自噬的化合物，其作用靶點仍然不清楚。因此，有必要確認自噬調節藥物的靶點，也有必要確定藥物是否在生理濃度下調節靶點活性，以及藥物是否通過特定的靶點起作用。開發更為特異的自噬調節劑對于臨床應用至關重要。褪黑素對腎臟衰老過程中的保護作用機制尚未得到深入研究。

本研究發現，在SD大鼠自然衰老過程中，其腎臟組織形態發生改變，腎小球萎縮，數量減少，腎功能減退，組織細胞凋亡增加，而在長期應用褪黑素后，腎臟組織形態改善，腎功能增強，細胞凋亡減少，提示褪黑素具有腎臟保護作用。mTOR在SD大鼠自然衰老過程中呈磷酸化激活狀態，自噬相關蛋白p62表達明顯增高，LC3B、Beclin1的表達降低；反之，應用褪黑素，mTOR受抑制，自噬相關蛋白p62表達減少，LC3B、Beclin1表達增高，上述結果提示mTOR信號通路介導的自噬與SD大鼠自然衰老過程密切相關。

綜上，本研究證實了褪黑素可以通過抑制mTOR激活自噬，減輕SD大鼠自然衰老過程中的腎臟損傷，這為褪黑素保護衰老引發的臟器損害提供了新的實驗依據。但是，褪黑素作用于mTOR信號通路是如何激活自然衰老過程中的自噬還不清楚，需要更深層次的研究闡述機制。