環境化學物暴露對妊娠期糖尿病生物信息學的影響

劉素琴，崔靜，孫健平，隋樹淼

1 青島市婦女兒童醫院，山東青島266011；2 青島市疾病預防控制中心 青島市預防醫學研究院；3 萊西市院上中心衛生院

妊娠期糖尿病（GDM）是在妊娠期間發生的自發性高血糖，是一種常見的妊娠并發癥［1］。盡管分娩后GDM 癥狀體征會消退，但其對母親及兒童的健康可產生長遠影響，并導致肥胖和糖尿病的代際惡性循環［2-3］。據國際糖尿病聯盟估計，2019年全球有2 040 萬20～49 歲的女性受GDM 影響，其患病率高達15.8%，且報道GDM 患病率隨著年齡增加而增長，45～49 歲 女 性 中GDM 的 患 病 率 更 是 高 達37.0%［4］。研究顯示，GDM 受遺傳、營養及生活方式等諸多因素影響［5］；但這些因素并不能完全解釋GDM 流行的嚴重性，越來越多的證據顯示環境化學物與GDM 的發生密切相關［6］。環境化學物廣泛存在在空氣、水和食物中，砷、環境細顆粒物、雙酚A及其代謝物、持久性有機污染物等均影響GDM 的發生發展［7-10］。目前雖然已經有了部分環境化學物對GDM 影響的研究，但是尚無二者交互作用分子層面全面而深入的報道。因此本研究采用生物信息學方法分析環境化學物質對GDM 影響的分子機制，為GDM的預測與防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 GDM 共同關聯基因篩選 2021年1月19日以“gestational diabetes mellitus”，“Homo sapiens”［porgn：__txid9606］為檢索詞在Pubmed 的Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫進行檢索，共檢索到14個可能與GDM 關聯的基因芯片，將檢索到含有非GDM 和GDM 樣本的基因芯片納入本研究。采用GEO2R對基因芯片中的非GDM組和GDM組的基因樣本進行中位數標準化分析，選取非GDM 組與GDM 組分別處在同一水平的基因芯片中的基因樣本導出后，篩選出P＜0.05 且∣lg FC∣＞1 的基因納入本研究。2021 年2 月2 日以“gestational diabetes mellitus”為檢索詞在比較毒理基因組數據庫（CTD，其網址為http：//ctdbase. org/）進行檢索，篩選出環境化學物質影響GDM 直接表達的基因納入本研究。將通過GEO 和CTD 數據庫挖掘出的基因通過jveen 在線軟件篩選出GDM共同關聯的基因進行分析。

1.2 基因富集分析 采用DAVID 在線軟件（網址為https：//david.ncifcrf.gov/）對GDM共同關聯的基因進行富集分析，富集分析主要包括基因本體論（GO）分析和信號通路分析。GO 分析主要包括生物學進程、細胞組分等，當錯誤發現率（FDR）＜0.01 為有統計學意義。信號通路分析是描述基因間各種生物學通路與代謝途徑的方法，本研究采用BIOCARTA信號通路分析法。

1.3 蛋白互作富集分析 采用String 在線分析軟件與Cytoscape 軟件的GeneMANIA 插件對GDM 共同關聯的基因進行蛋白互作分析，并預測GDM 共同關聯蛋白間的共表達、共定位等作用以及其節點蛋白。采用Cytoscape 軟件的GeneMANIA 插件和Mcode插件對GDM共同關聯的基因進行分子復合物檢測（Mcode），并挖掘每個Mcode模塊的節點蛋白。

1.4 影響Mcode 模塊環境化學物質的篩選 通過Excel 將各Mcode 模塊的節點蛋白/基因與CTD 數據庫的基因比較，篩選出影響各Mcode模塊的環境化學物質。

2 結果

2.1 GDM 共同關聯基因 GEO 數據庫顯示有4 套與GDM 相關聯的基因芯片，見表1。與GDM 相關聯的基因芯片中P＜0.05 且∣lg FC∣＞1 的基因有84 個，CTD 數據庫顯示與GDM 相關聯的基因共有12 924個。通過jveen在線軟件分析顯示，兩種數據庫共有59個與GDM共同關聯的基因。

表1 與GDM相關基因芯片基本信息

2.2 基因富集 GO 分析顯示，GDM 共同的關聯基因主要集中在細胞外基質（P＜0.01 且FDR=0.002）、血管再生（P＜0.01 且FDR=0.022）、胚胎肢體形態發育（P＜0.01 且FDR=0.046）、單生物細胞-細胞黏附（P＜0.01 且FDR=0.046）等生物學進程以及細胞外區域（P＜0.01 且FDR=0.008）等細胞組分。見表2。BIOCARTA 信號通路富集分析顯示，GDM 共同的關聯基因主要參與了IL-10 抗炎（P=0.10 且FDR=1.00）、Ghrelin（P=0.10 且FDR=1.00）等信號通路。見表3。

表3 GDM關聯的基因BIOCARTA通路分析

2.3 蛋白互作網絡 String 在線軟件與Cytoscape軟件中GeneMaNIA 分析顯示，GDM 共同的關聯蛋白共有52 條邊，平均蛋白節點度為1.62，局部聚類系數為0.434，其中共表達的蛋白有1 048對，共定位的有127對，基因互作的有287對，通路的有19對，物理互作的有54 對，預測的有22 對，蛋白域共享的有68對，蛋白互作網絡差異具有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 GDM 關聯基因Mcode 模塊及其影響環境化學物質 Cytoscape 軟件Mcode 模塊化分析顯示，與T2DM 關聯的關鍵基因共有6個基因模塊，最復雜模塊是Mcode 1，其包含9 個節點蛋白，分別為COL4A1、FILIP1L、ROR1、FOXF1、LOXL1、CXCL12、DDR2、IGFBP5、TAGLN；其次為Mcode 6，包含8 個節 點 蛋 白，分 別 為TGFBI、FAT1、EMCN、GPX7、CD44、LDB2、VASH1、COLEC12。影響各個模塊的環境化學物質主要為砷、莠去津、鎘、二嗪農、二甲雙胍、農藥等。見表4。

3 討論

環境化學物質對GDM 的影響已引起國內外廣泛關注，但目前缺乏系統的關于環境化學物質暴露與GDM 效應間分子生物學機制的闡釋。本研究顯示有59 個與GDM 共同關聯的基因。GO 分析與GDM 關聯的基因主要集中在細胞外基質組織、血管再生、胚胎肢體形態發育、單生物細胞-細胞黏附以及細胞外區域等；BIOCARTA 信號通路富集分析GDM 共同的關聯基因主要參與了IL-10 抗炎信號通路、Ghrelin 等信號通路；蛋白互作網絡分析顯示GDM 共同的關聯蛋白共有6 個模塊，影響各個模塊的環境化學物質主要為砷、莠去津、鎘、二嗪農、二甲雙胍、農藥等。

表4 GDM關聯基因Mcode模塊及其影響環境化學物質

GDM 是孕期發生的一系列的葡萄糖代謝異常，其發病機理尚未完全了解，但免疫炎性因子是GDM發病的主要機制之一。砷、鎘、莠去津等環境化學物質作為全球關注的熱點，已有研究表明能夠引起IL-10廣泛參與的免疫炎性反應［13］。

IL-10是一種重要的抗炎細胞因子，可以由多種細胞合成和分泌，同時其還可以抑制多種炎性細胞產生炎性細胞因子。研究顯示GDM 患者的血漿IL-10 水平顯著低于健康對照者，且低IL-10 水平與GDM 患者的胰島素抵抗負相關，這表明低水平IL-10與GDM的胰島素抵抗相關［14］。此外，還有研究顯示IL-10 等位基因與GDM 易感性風險顯著相關［15］。IL-10 不僅在機體的免疫反應中起著重要的調節作用，而且參與到許多組織和器官的細胞活化、增殖、分化等過程中，這也從側面印證了我們的研究，環境化學物通過影響IL-10抗炎信號通路來影響GDM 者的細胞外基質組織、血管再生、胚胎肢體形態發育、單生物細胞-細胞黏附以及細胞外區域等生物學進程或細胞組分。

Ghrelin 是一種致食性肽，主要由胃底細胞分泌，能夠調節食物攝入和能量代謝，其在調節肥胖、糖尿病等疾病中起到重要的作用［16］。機體的Ghrelin 水平受飲食、運動、生活方式及環境等多種因素影響，但目前還未有Ghrelin 受環境化學物質影響的報道。妊娠期糖尿病涉及Ghrelin 相關的食物攝入和能量代謝，但目前鮮有報道妊娠期糖尿病與Ghrelin關系的研究，有研究顯示Ghrelin激動劑能夠治療糖尿病性胃輕癱、厭食癥及病理性體重不足，而Ghrelin 受體抑制劑可能對肥胖者減重及改善葡萄糖代謝有著治療價值［17］。有研究報道妊娠期女性有較低的血漿Ghrelin，且產后12周內這種低水平持續存在［18］；另有報道GDM 女性在產后2 天血清Ghrelin水平較高，但尿中Ghrenlin 水平較低［19］。而上述一些列的差異可能是由于GDM 患者體內炎性因子分泌異常而導致Ghrelin 代謝紊亂［20］。考慮到目前關于GDM 與Ghliren 的研究較少，因此對二者關系及機制進行深入而細致的探討是有必要的

綜上所述，砷、莠去津、鎘、二嗪農、二甲雙胍、農藥等環境化學物可能通過影響IL-10、Ghrelin等信號通路來影響GDM 的發生發展，進而影響胎兒的細胞外基質組織、血管再生、胚胎肢體形態發育、單生物細胞-細胞黏附以及細胞外區域等生物學進程或細胞組分。因此，研究環境化學物與GDM 之間分子生物學機制，可以為更加精準地研究、預防、干預和治療GDM提供新思路。