BTLA在宮頸鱗癌組織中的表達與臨床意義以及對宮頸癌Hela細胞生物學行為的影響

王林芳 張亞潔 馬思晨 朱繡玉 閆洪超

宮頸癌發生率位居所有婦科惡性腫瘤首位，其發生、發展與細胞內多種基因的異常表達有關。這些異常的基因表達是腫瘤發生的主要原因之一，其表達量變化往往能夠影響腫瘤的增殖、侵襲等多種生物學行為[1，2]。B、T淋巴細胞弱化因子(BTLA)于2003年由Gavrieli等[3]在進行基因篩選實驗時發現，是一個具有免疫球蛋白樣結構的CD28家族共抑制受體，近年來已成為研究熱點。目前多項有關BTLA的研究發現，在子宮內膜癌、卵巢癌等多種婦科惡性腫瘤中均存在BTLA的異常高表達，但關于其在宮頸癌中的表達情況及對宮頸癌發生、發展的影響仍不明確。本研究旨在運用免疫組化方法檢測BTLA在宮頸鱗癌組織中的表達水平并分析其臨床意義，運用RNAi技術沉默宮頸癌Hela細胞中BTLA基因的表達，并觀察沉默BTLA對Hela細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，通過深入探討BTLA在宮頸鱗癌發生、發展中的作用，為宮頸鱗癌的基因治療提供全新的方向。

材料與方法

1.宮頸鱗癌組織及細胞來源：收集宮頸鱗癌組織60例、宮頸鱗狀上皮內病變組織30例(低級別15例，高級別15例)及宮頸炎癥組織30例，均為徐州醫科大學病理科2017年1月～2018年12月手術切除的標本。納入標準：患者臨床、病理資料完整。排除標準：除外合并其他系統的惡性腫瘤、來自于生殖系統其他器官腫瘤的轉移癌(包括原發性雙癌)及首次治療為化療、放療或內分泌治療。宮頸鱗癌患者按2009年FIGO分期，組織學按WHO分級。本研究均通過筆者醫院醫學倫理學委員會批準。宮頸癌Hela細胞購自北京北納創聯生物技術研究院，在 37℃、5%CO2的培養箱內，用含10%胎牛血清的DMEM-H培養基培養，用2.5g/L胰蛋白酶消化液消化后對細胞進行傳代培養，每隔3～5天傳代1次。

2.免疫組化染色：標本石蠟包埋后連續切片，厚度4μm，HE常規染色。按照常規方法對石蠟切片進行脫蠟和水化，按PV-9001免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明書進行染色。BTLA兔抗人多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司。鏡下觀察結果，以陽性細胞數目的百分比結合染色強度進行半定量分析。按著色強度依次分為0～3分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色無陽性細胞計0分，陽性細胞數占計數細胞1%～30%計1分，31%～70%計2分，71%～100%計3分。每張切片進行兩項分數相加，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)，0分為陰性(-)。

3.siRNA轉染：由上海吉瑪制藥有限公司設計并化學合成特異性靶向BTLA基因的siRNA，包括siRNA-1正義鏈:5′-CCUGGUUGAUGCUCACCUUTT-3′,反義鏈:5′-AAGGUGAGCAUCAACCAGGTT-3′;siRNA-2正義鏈: 5′-CCAC-UCAACAACUCUUUAUTT-3′,反義鏈:5′-AUAAAGAGUUGUUGAGUGGTT-3′;siRNA-3正義鏈: 5′-GCUUGGAACUGGG AAAUUATT-3′, 反義鏈:5′-UAAUUUCCCAGUUCCAAGCTT-3′。將對數生長期的Hela細胞制備成單細胞懸液(5.0×105/ml)接種在6孔板中，每孔2.0ml細胞懸液，待細胞生長至融合達70%～80%，參考Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)說明書向Hela細胞中轉染每種單獨的siRNA或siRNA-1、2、3均勻混合的siRNA-MIX，以獲得4種BTLA siRNA組，即siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組和siRNA-MIX組，孵育6h后更換常規新鮮培養基繼續培養；陰性對照組(siRNA-NC組)：正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈:5′-ACGUGACACG-UUCGGAGAATT-3′；轉染非特異性的siRNA-NC以作為后續實驗的陰性對照組，操作同上。

4.qRT-PCR：于轉染24h后收集各組細胞，應用Trizol(上海拜力生物科技有限公司)法提取細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA后應用qRT-PCR檢測BTLA mRNA表達水平。BTLA的PCR引物序列：上游5′-GCACCAGGCAAAATTCCCA AG-3′，下游5′-TTCGGTCCAATGACAGAATGG-3′。GAPDH為內參對照，其引物序列為：上游:5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。引物序列由上海吉瑪制藥有限公司設計合成。RT-PCR和qRT-PCR試劑盒購自美國諾唯贊生物科技有限公司。反應條件：預變性95℃ 30s，變性95℃ 10s，退火56℃ 30s，延伸72℃ 30s，循環40次。2-△△Ct法計算目的基因相對表達量，每個檢測重復3次。

5.Western blot法：轉染48h后用含PMSF的細胞裂解液將細胞裂解，收集蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進行Western blot法檢測，一抗稀釋比例為1∶1000，二抗稀釋比例為1∶5000，使用Odyssey雙色紅外激光成像系統成像。內參兔抗人GAPDH多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。Image J軟件進行灰度分析。每組實驗重復3次。

6.CCK-8法檢測細胞增殖能力：取上述各組Hela細胞以每孔1.0×104個接種于96孔板，每孔設置6個復孔，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別在細胞培養0、12、24、36、48h后加入CCK-8溶液(大連美侖生物技術有限公司)10微升/孔，繼續孵育1h，酶標儀測450nm處吸光度(A)值。計算6孔A值平均值，以時間(T)為橫軸，以A值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

7.Transwell法檢測細胞侵襲能力：溶解Matrix(1∶8稀釋，康寧有限公司)，收集上述各組細胞，以無血清培養基重懸，4.0×104個細胞接種至涂有基質膠的Transwell上室中。在下室加入含有20%胎牛血清的DMEM-H培養基。24h后吸除所有培養基，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色。用棉簽擦去附著于小室底膜上層的細胞，倒置光學顯微鏡以200倍拍攝，隨機計數6個視野的細胞數量。

8.劃痕實驗檢測細胞遷移能力：細胞轉染24h后，使用無菌的10μl移液槍頭沿直尺在6孔板底部輕輕劃痕；用PBS洗去脫落的細胞后，加入無血清培養基，取不同視野拍照記錄劃痕0h和24h后情況。遷移率=(1～24h劃痕面積/0h劃痕面積)×100%。

9.統計學方法：應用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行統計分析，不同宮頸組織中、不同臨床病理特征間BTLA蛋白陽性表達的比較分別采用非參數檢驗和χ2檢驗；兩組細胞各指標的比較采用單因素方差分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.BTLA在宮頸鱗癌組織中存在異常高表達：BTLA陽性細胞表現為細胞膜棕黃色著色。BTLA在低級別宮頸鱗狀上皮內病變、高級別宮頸鱗狀上皮內病變及宮頸鱗癌組織中均有表達，其陽性率呈上升趨勢，分別為46.7%、60.0%和91.7%，與宮頸炎癥組織比較，差異有統計學意義(P=0.000，圖1)。

圖1 各種宮頸組織中BTLA蛋白的表達(HE，×200)

2.BTLA的表達與宮頸鱗癌的惡性程度有關：宮頸鱗癌患者的年齡及腫瘤的分化程度與BTLA的陽性表達無相關性(P>0.05),而腫瘤臨床分期、肌層浸潤深度、是否淋巴結轉移等則與BTLA的陽性表達有相關性(P均<0.05)。早期(Ⅰ期)宮頸鱗癌病例的BTLA陽性率顯著低于中期(Ⅱ期)病例樣本(P<0.05)，腫瘤的宮頸肌層浸潤深度及是否伴有淋巴結轉移也會影響患者的BTLA陽性表達率(P<0.05，表2)。

表2 BTLA的表達與宮頸鱗癌臨床病理指標的相關性

3.siRNA干擾宮頸癌Hela細胞中 BTLA的mRNA及蛋白表達水平：對上述轉染操作獲得的6組細胞進行qRT-PCR及Western blot法檢測，結果表明，與Blank組比較，siRNA-NC組細胞中BTLA的mRNA及蛋白水平無明顯變化(P>0.05)；與siRNA-NC組比較，4種干擾組細胞中BTLA的mRNA及蛋白水平均明顯下降，差異有統計學意義(P=0.000)，其中siRNA-MIX相較其余3種siRNA干擾Hela細胞BTLA的mRNA及蛋白水平效果最顯著，最終選擇siRNA-MIX組Hela細胞進行后續體外實驗(圖2、圖3)。

圖2 RNA干擾對Hela細胞BTLA的mRNA表達的影響

圖3 RNA干擾對Hela細胞BTLA的蛋白表達的影響

4.干擾BTLA表達能夠抑制Hela細胞的增殖能力：對siRNA-NC組和siRNA-MIX組細胞行CCK-8細胞增殖實驗，在24、36、48h時，siRNA-MIX組與siRNA-NC組細胞比較，其A值顯著降低(P<0.01)(圖4)。

圖4 RNA干擾對Hela細胞增殖能力的影響

5.干擾BTLA表達能夠抑制Hela細胞的侵襲能力：對siRNA-NC組和siRNA-MIX組Hela細胞進行Transwell實驗，siRNA-MIX組侵襲至Transwell小室底膜下層的細胞數顯著低于siRNA-NC組(P=0.000，圖5)。

圖5 RNA干擾對Hela細胞侵襲能力的影響(結晶紫，×200)

6.干擾BTLA表達能夠抑制Hela細胞的遷移能力：與siRNA-NC組比較，siRNA-MIX組細胞的遷移能力明顯降低(P<0.05，圖6)。

圖6 RNA干擾對Hela細胞遷移能力的影響

討 論

BTLA是T細胞表面的共刺激分子CD28家族的一個新成員，是一種表達于細胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其結構類似于CTLA-4和PD-1，為具有兩個免疫受體酪氨酸抑制基序的免疫球蛋白[4，5]。BTLA能夠與其配體皰疹病毒進入介質(herpesvirus entry mediator, HVEM)相互作用，導致基于免疫受體酪氨酸的抑制基序磷酸化和SHP2蛋白募集，致使IL-2的產生減少和T細胞的增殖抑制，并下調機體的免疫應答水平，從而產生免疫抑制效應。BTLA在活化的T細胞內存在高表達，并持續表達于Th1細胞，其缺失會導致T細胞增殖增加。有關BTLA的研究顯示，T細胞缺失小鼠的過敏性氣道反應、自身免疫性腦脊髓炎等疾病的嚴重程度均有上升[6]。同時，BTLA在多種人類實體腫瘤中存在高表達，且其異常高表達往往與腫瘤的惡性進展相關。如在婦科疾病中常見的卵巢癌，研究人員發現BTLA的高表達與患者的不良預后相關，抑制BTLA表達聯合化療可提高卵巢癌小鼠模型的免疫活性并增強化療的抗腫瘤效果[7]。在非小細胞肺癌中，BTLA高表達預示患者的不良預后，其高表達不僅能促進腫瘤的浸潤和淋巴轉移，還能上調PD-1——非小細胞肺癌的免疫治療靶點基因的表達[8]。研究人員在肝癌中也得到了同樣的結果，即BTLA在肝癌細胞中表達上調，且超過50%的PD-1陽性肝癌細胞存在BTLA高表達[9]。類似的，BTLA高表達還會嚴重影響包括彌漫性大B細胞淋巴瘤等血液系統腫瘤、胰腺癌、間皮瘤、結核性胸膜炎在內的多種疾病患者的免疫調控及預后[10～12]。BTLA還能與NKT細胞聯合作用，研究表明，干擾乳腺癌小鼠模型中BTLA的表達能夠提高小鼠體內Ⅰ型NKT細胞的數量，并減少腫瘤的生長和肺轉移。Lan等[13]、金煜翔等[14]也分別通過研究發現BTLA在胃癌及食管鱗癌組織中存在異常高表達，且與淋巴結轉移和TNM分期顯著相關。

因此，雖然BTLA在多種實體瘤中存在異常表達，但卻鮮有研究探討其與婦科發生率最高的腫瘤——宮頸癌的發生、發展之間的關系，僅韓凌斐等[15]通過BTLA胞外段阻斷BTLA/HVEM通路，有效增強了HSP抗原肽產生的抗腫瘤免疫效應。本研究將BTLA與宮頸癌相聯系，首先通過免疫組化方法檢測臨床宮頸鱗癌組織樣本中的BTLA表達，結果顯示BTLA在宮頸炎癥組織、宮頸鱗狀上皮內病變組織及宮頸鱗癌組織樣本中的表達程度呈現遞增趨勢，且宮頸鱗癌TNM分期越高、淋巴結轉移越廣泛，其BTLA陽性表達程度也越高，表明BTLA表達水平與宮頸鱗癌的惡性程度及進展呈正相關。為了進一步探究BTLA在宮頸癌發生、發展中的具體作用，筆者使用化學合成的靶向BTLA的siRNA轉染宮頸癌Hela細胞系，特異性干擾Hela細胞內BTLA的表達，獲得了低表達BTLA的Hela細胞。筆者分別通過CCK-8、Transwell及劃痕愈合實驗，檢測了干擾BTLA表達的Hela細胞的增殖、侵襲及遷移能力變化，結果顯示靶向干擾Hela細胞內BTLA的表達能夠顯著抑制其增殖、侵襲及遷移能力，這表明高表達的BTLA在宮頸癌惡性進展中具有重要的作用。然而本研究總體樣本量較小，所進行實驗未能涉及更深層次的作用機制，仍需開展后續研究探索BTLA具體的作用機制。

綜上所述，BTLA作為新發現的宮頸鱗癌中異常高表達的因子，其高表達與宮頸鱗癌的惡性進展呈顯著正相關，且能促進宮頸癌細胞的多種惡性能力，針對BTLA的靶向療法有望為宮頸鱗癌的治療提供全新的思路。