布魯菌蛋白抗原的研究進展

肖林萍 蘭英華

布魯菌病是一種人獸共患傳染病，有多種臨床表現，如波狀熱、多汗、肝脾腫大、淋巴結腫大、關節炎、睪丸炎等，累及多個系統，由于缺乏特異性表現和敏感度較高的診斷方法，極易造成誤診、漏診，貽誤治療。目前布魯菌血清學診斷方法主要應用布魯菌脂多糖(LPS)作為診斷性抗原，但此抗原與耶爾森菌、志賀菌、霍亂弧菌的成分存在交叉反應，易造成假陽性，而且在患者痊愈后數月甚至數年檢驗結果仍可能為陽性，不利于區別現癥感染與既往感染。因此，為準確診斷布魯菌病必須找到免疫原性和免疫反應性更強的布魯菌蛋白抗原。

一、外膜蛋白

布魯菌的細胞膜由3層膜結構組成，從內向外依次為細胞質膜、外周胞質膜和外膜。布魯菌的外膜是由脂多糖(LPS)、外膜蛋白(Omp)、孔蛋白共價結合于磷脂雙分子層構成的[1,2]。布魯菌表面的蛋白最早與宿主細胞相互作用，不僅可以誘導細胞免疫反應，也可以誘導機體產生特異性抗體[3]。目前已確定的外膜蛋白共有7種，依據相對分子質量將其分為3組。

1.第1組外膜蛋白：相對分子質量為10、18、19kDa，分別為Omp10、Omp16、Omp19，均為脂蛋白[2,7]。布魯菌脂蛋白可激發單核-吞噬細胞和樹突狀細胞分泌細胞因子，在誘導宿主細胞產生炎性反應過程中發揮著重要作用[4,5]。韓國的一項研究應用重組外膜蛋白rOmp10、rOmp19、rOmp28進行實驗，體外實驗發現經3種蛋白抗原刺激后，RAW-264.7細胞的TNF-α和IL-6分泌水平明顯升高。分組進行小鼠免疫接種后，發現抗體水平在3組免疫小鼠中均有明顯升高，而且IgG1和IgG2a水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，說明免疫反應由Th-1介導轉變為Th-2介導[6]。該研究說明了Omp10、Omp19在體內和體外實驗中均具有免疫反應性，其免疫學特性及其應用需進一步探究。

Alizadeh等[7]應用重組布魯菌外膜蛋白rOmp16免疫注射小鼠發現IgG水平顯著升高，且免疫小鼠離體脾臟細胞經rOmp16再次刺激后，IFN-γ和IL-4分泌水平升高。免疫4周后，人為造成免疫小鼠布魯菌感染14天，之后取小鼠脾臟細胞對布魯菌菌落進行計數，發現經rOmp16免疫小鼠脾臟菌落數平均為0.12 Log CFU，而未經免疫小鼠脾臟菌落數平均為4.93 Log CFU。該研究說明了Omp16是一種潛力抗原，能夠激發顯著的抗體反應，同時免疫小鼠分泌高水平的IFN-γ，說明rOmp16能夠激發Th1免疫反應。

2.第2組外膜蛋白：相對分子質量為36～38kDa，主要為Omp2，其本質為孔蛋白。第2組外膜蛋白的編碼基因由2個基因組構成，分別為Omp2a和Omp2b，其基因相似性超過85%[1,2]。Prachi等[8]研究顯示，rOmp2a診斷人類布魯菌病的敏感度為93.75%，特異性為95.83%，說明 Omp2a可以作為人類布魯菌病血清學診斷抗原應用于臨床。

有研究者利用生物信息學方法預測出Omp2b的T-B細胞聯合表位，對30例布魯菌病患者進行ELISPOT實驗和ELISA實驗。實驗結果顯示，T-B細胞聯合表位能夠誘導布魯菌病患者T細胞分泌高水平的IFN-γ，并引發布魯菌病患者產生高水平特異性抗體[9]。該研究證實了Omp2b具有免疫原性，能夠誘導細胞免疫應答，可以作為布魯菌病的候選疫苗，也可以利用其免疫特性作為診斷性抗原。

3.第3組外膜蛋白：相對分子質量為31～34kDa、25～27kDa，包括Omp25、Omp28、Omp31[1,2]。Yousefi等[10]對Omp25和BLS(二氧四氫蝶啶合酶)布魯菌嵌合體抗原進行免疫評估。BLS廣泛存在于各型布魯菌細胞質中，是一種有佐劑性質的免疫原性蛋白，能夠誘導免疫小鼠Th1和Th2免疫反應[10,11]。該研究分組進行小鼠免疫實驗，其中Omp25-BLS嵌合體抗原組IgG1、IgG2a水平均高于其他實驗組。細胞免疫方面,OMP25-BLS嵌合體抗原聯合HSP60組的淋巴細胞增殖數目和TNF-α分泌水平最高，說明其誘導細胞免疫應答作用較強。

Omp28又稱Bp26，廣泛存在于各型布魯菌中，被認為是最具潛力的血清學診斷性抗原[12～14]。現有血清學診斷依賴LPS或整個細胞提取物，易造成假陽性，為突破這一瓶頸，許多研究應用重組布魯菌抗原rOmp28進行ELISA試驗檢測布魯菌。其中Thavaselvam等[13]研究發現，rOmp28 iELISA試驗敏感度、特異性分別為97.50%和85.59%，點印跡ELISA試驗敏感度、特異性分別為82.05%和92.43%。該方法的敏感度、特異性都比虎紅試驗和試管凝集試驗高。Tiwari等[14]應用重組布魯菌抗原rOmp28和rOmp31進行iELISA試驗，rOmp28診斷敏感度、特異性分別為91.6%和97.6%，rOmp31診斷敏感度、特異性分別為62.2%和94.7%。以上研究證實了Omp28診斷敏感度、特異性更高，更有潛力應用于臨床診斷。

Omp31存在于除牛種布魯菌之外的所有布魯菌菌株中，具有免疫保護和免疫診斷潛力，是重要的免疫原性蛋白[15～17]。Zhang等[17]應用生物信息學技術篩選得到了Omp31的T細胞表位、B細胞表位和T-B細胞聯合表位，經鼻黏膜免疫小鼠。經Omp31的B細胞表位和T-B細胞聯合表位免疫后IgG1、IgG2a水平顯著升高，經Omp31的T細胞表位和T-B細胞聯合表位免疫后呼吸系統淋巴結和脾臟中IFN-γ分泌細胞數目增多。人為應用感染經3類表位免疫后小鼠，小鼠體內細菌量明顯少于陰性對照組。該研究證實Omp31的免疫原性，既可以誘導體液免疫，也可以誘導細胞免疫，保護機體免受布魯菌感染。因此，可作為特異性抗原應用于布魯菌病的診斷和新型疫苗的開發。

二、菌體蛋白

除了上述布魯菌外膜蛋白外，還有一些菌體蛋白同樣具有免疫原性，其中Cu/Zn 超氧化物歧化酶、二氧四氫蝶啶合酶(BLS)、熱休克蛋白(HSP60)已在前文中提及。

1.Ⅳ型分泌系統：是布魯菌毒力因子的重要組成成分，是由12 種蛋白(VirB1～VirB12)構成的蛋白復合體，能夠幫助布魯菌躲避宿主的免疫監視，形成持續性感染，其效應蛋白能夠促進細胞因子產生，利于布魯菌在細胞之間擴散[18]。國外一項研究通過生物信息學技術篩選出可以被布魯菌病患者血清識別的50種蛋白質，利用免疫表位數據庫對50 種蛋白質進行優勢表位預測，應用優勢表位進行酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)。結果表明經Ⅳ型分泌系統中的VirB5 蛋白特定表位刺激后，急性與復發布魯菌病患者的IFN-γ水平顯著升高[19]。Mirkalantari等[20]應用重組布魯菌抗原rVirB12對收錄的布魯菌病患者進行ELISA試驗，該方法診斷的特異性、敏感度、準確率分別為87.8%、94.0%和90.0%。以上研究表明布魯菌Ⅳ型分泌系統中的VirB5蛋白能夠激發細胞免疫反應，通過檢測相關細胞因子分泌水平可以診斷布魯菌病，并且證實了VirB12蛋白具有布魯菌血清學診斷潛力。

2.L7/L12蛋白：是布魯菌核糖體的重要組成成分，參與蛋白質的合成過程，能夠介導細胞免疫反應和體液免疫反應，使得CD4+T細胞增殖，IFN-γ分泌增多。Senevirathne等[21]應用布魯菌L7/L12抗原設計了一種布魯菌疫苗。實驗結果顯示，沙門菌分泌—轉運系統攜帶L7/L12抗原組小鼠IgA、IgG產生水平顯著升高，且細胞因子IFN、IL-4分泌水平同樣顯著升高。實驗小鼠免疫21天后，人為應用布魯菌感染小鼠14天后，取小鼠脾臟、肝臟細胞進行布魯菌菌落計數，免疫組小鼠的菌落計數明顯降低。以上研究說明L7/L12具有免疫原性，經特異性地轉運至細胞或組織中，可以更加高效地誘導機體產生體液免疫反應和細胞免疫反應，進而應用于新型疫苗研發。

3.P39蛋白：是結合蛋白依賴轉運系統的一種結合蛋白，在蛋白質折疊和應激保護中發揮重要作用。Tadepalli等[22]應用混合重組布魯菌抗原rOmp19+rP39進行布魯菌感染小鼠體內免疫實驗，發現免疫后小鼠體內抗體水平升高，且以Th1免疫反應介導的亞型IgG2a為主。分離免疫小鼠脾臟細胞，rOmp19+rP39聯合免疫組小鼠IFN-γ、IL-2、IL-12分泌水平高于rOmp19免疫組和rP39免疫組。該研究說明Omp19+P39混合抗原具有高度免疫原性，能夠激發Th1為主的抗體產生和T細胞介導的免疫保護，對于疫苗的研發有重要啟示作用，同樣依據其免疫原性可以應用于布魯菌病的血清學診斷中。

綜上所述，本文中提及的外膜蛋白(Omp)和菌體蛋白免疫原性較強，能夠激發宿主細胞免疫反應和體液免疫反應，尤其是能夠激發Th1細胞產生INF-γ、IL-2、TNF-β等細胞因子，為宿主提供免疫保護，對于研發更高效的、可應用于人類的布魯菌疫苗有重要意義。也有許多研究利用重組布魯菌外膜蛋白或重組菌體蛋白進行ELISA試驗診斷布魯菌病，診斷的準確率、敏感度和特異性均較高，尤其是Omp28(Bp26)被認為是最具潛力的血清學診斷抗原。除此之外，依據這些蛋白抗原的免疫原性，也可以通過檢測這些蛋白抗原激發細胞免疫釋放的高水平的細胞因子，從而進行布魯菌血清學的特異性臨床診斷。應用本文所述的布魯菌蛋白抗原，有望開發更加準確、特異的布魯菌診斷方法。