無菌體液分離的肺炎克雷伯菌耐藥及毒力因子研究

孫守棟 陳 燁 朱靜軒 楊雪靜

肺炎克雷伯菌易定植于腸道、呼吸道等部位，是目前臨床院內(nèi)感染及社區(qū)獲得性感染的重要病原體之一。近年來，隨著診療技術(shù)增加及廣譜抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌引起的無菌體腔感染越來越受到臨床重視[1～3]。現(xiàn)國內(nèi)外有關(guān)分離自無菌體液的肺炎克雷伯菌的毒力因子及耐藥性綜合分析報(bào)道較少，本研究對(duì)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集的SBF-KP菌株的臨床分布、藥敏狀況、黏液表型、莢膜血清型及毒力基因攜帶情況進(jìn)行分析，以期為臨床診治無菌體液肺炎克雷伯菌感染提供參考。

材料與方法

1.菌株來源：收集浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院2017年8月～2019年12月無菌體液標(biāo)本(胸腹腔積液、膿液、膽汁、腦脊液、關(guān)節(jié)腔積液、骨髓等，不包括血液及尿液)分離的肺炎克雷伯菌83株，剔除同一患者重復(fù)菌株。無菌體液：在標(biāo)本采集、標(biāo)本處理過程中嚴(yán)格無菌操作，分離出的細(xì)菌被認(rèn)為是感染菌的液體標(biāo)本。

2.儀器與試劑：MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Bruker)、Vitek-2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)、PCR 儀(美國 Bio-Rad 公司)、10×AceTaq PCR Buffer(含Mg+2)及PCR試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司、電泳儀及紫外凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)、細(xì)菌核酸提取盒[天根生化科技(北京)有限公司]、PCR擴(kuò)增引物合成及產(chǎn)物測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

3.菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)：按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行無菌體液標(biāo)本采集與細(xì)菌分離培養(yǎng)，陽性菌株采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀及Vitek-2 Compact 系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)(質(zhì)譜儀鑒定率需達(dá)到2.0以上)。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922，藥敏結(jié)果采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLIS)推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

4.高黏液型鑒定：用接種環(huán)挑取血平板待測(cè)菌株，挑起的黏液絲長度≥5mm，為黏液絲試驗(yàn)陽性，重復(fù)3次以上確定為高黏液菌株。

5.PCR擴(kuò)增及序列分析：對(duì)無菌體液分離的肺炎克雷伯菌常見莢膜型K1、K2、K57、K5、K20、K54基因及uge、wabG、ycf、ureA、fimH、rmpA、rmpA2、aerobactin、iucA、magA、wcaG、ybtA、kfuB、iroB、alls、iutA、entB毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析。反應(yīng)條件、反應(yīng)體系、引物合成參照文獻(xiàn)[4～7]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列與GenBank數(shù)據(jù)庫在線比對(duì)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用WHONET 5.6軟件剔除重復(fù)株后進(jìn)行藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.標(biāo)本來源：共收集SBF-KP菌株83株，其中膿液的檢出率最高，為47.0%(39/83)；其次為腹腔積液、膽汁、胸腔積液穿刺液、腦脊液、骨髓，分別為21.7%(18/83)、16.9%(14/83)、7.2%(6/83)、6.0%(5/83)和1.2%(1/83)。

2.藥敏結(jié)果：83株SBF-KP對(duì)臨床14種抗菌藥物均有不同程度耐藥，其中對(duì)復(fù)方新諾明、氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸、左旋氧氟沙星耐藥率較高，均大于20%；對(duì)替加環(huán)素、阿米卡星、碳青霉烯類具有較好的藥物敏感度，耐藥率分別為6.0%(5/83)、7.2%(6/83)、9.6%(8/83，表1)。

表1 無菌體液分離的肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3.莢膜型及高黏液型分布：SBF-KP菌株莢膜型以K1、K2型為主，陽性率分別為39.8%(33/83)、13.3%(11/83)，檢測(cè)到1株K5莢膜型SBF-KP菌株。SBF-KP高黏液型陽性率為57.9%(48/83)，高黏液型菌株K1、K2莢膜型陽性率分別為45.8%(22/48)、18.8%(9/48)。

4.毒力基因檢測(cè)：17種毒力基因中entB、fimH、uge、wabG、ureA、ycf基因檢出率最高，均大于98.0%；其余毒力基因均有檢出，其中iroB檢出率最低，為9.6%(8/83，表2，圖1)。

圖1 rmpA2基因電泳圖

表2 無菌體液分離肺炎克雷伯菌毒力因子分布

5.無菌體液中膿液與其他無菌體液毒力因子差異：48株高黏液型菌株中，膿液、其他無菌體液分離的菌株分別為34、14株；膿液標(biāo)本與其他無菌體液在高黏液表型、rmpA、aerobactin、kfuB檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

高黏液表型是高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)最主要的毒力特征之一，黏液表型調(diào)解因子A(rmpA、rmpA2)對(duì)維持菌株高黏液型具有重要意義；rmpA、rmpA2位于180～220kb的質(zhì)粒上，可協(xié)同鐵載體等其他毒力因子調(diào)控菌株毒力表達(dá)。本研究SBF-KP菌株rmpA、rmpA2基因陽性率較既往HvKP研究低，且菌株高黏液表型與rmpA、rmpA2基因陽性率不一致，部分?jǐn)y帶黏液表型調(diào)解因子A菌株并不表達(dá)高黏液表型，考慮可能與氣桿菌素(aerobactin)、wcaG、rfbP等毒力因子基因缺失有關(guān)[10,11]。另外本研究發(fā)現(xiàn)，無菌體液中膿液標(biāo)本的高黏液表型陽性率高于其他無菌體液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，猜測(cè)可能與rmpA基因調(diào)控有關(guān)。莢膜多糖過度分泌可使肺炎克雷伯菌呈高黏液表型，根據(jù)莢膜多糖可將肺炎克雷伯菌分為82種莢清型，其中K1、K2型毒力較強(qiáng)且與HvKP密切相關(guān)[12,13]。magA位于染色體上，與肺炎克雷伯菌K1莢膜型合成相關(guān)，alls基因主要編碼尿囊素調(diào)節(jié)因子激活劑，并且與氣桿菌素的生成密切相關(guān)，wcaG基因主要編碼菌株莢膜中的巖藻糖成分，有助于逃避吞噬細(xì)胞的吞噬作用。本研究發(fā)現(xiàn)SBF-KP菌株莢膜型以K1/K2高毒型為主，比例大于50%，且alls、magA基因僅存在于K1型肺炎克雷伯菌中，與相關(guān)報(bào)道一致[14,15]。席健峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)wcaG基因僅存在K1型肺炎克雷伯菌中，本研究中wcaG在K1、K2型以及未分型菌株均有檢出，與其結(jié)果不符。

肺炎克雷伯菌鐵攝取相關(guān)毒力因子(aerobactin、iutA、iucA、ybtA、entB、iroB、kfuB、ycf)對(duì)維持菌株定植、侵襲、高毒性具有重要作用，其中氣桿菌素aerobactin因子是其最主要的毒力因子[17]。Yu等[6]研究發(fā)現(xiàn)K1、K2 莢膜型肺炎克雷伯菌aerobactin的檢出率為 100%，本研究K1、K2 莢膜型肺炎克雷伯菌均攜帶aerobactin基因，與其報(bào)道一致。iucABCD是氣桿菌素的基因編碼簇，本研究iucA與rmpA基因陽性率稍有差別，與iucABCD、rmpA基因位于同一質(zhì)粒報(bào)道不符[18]。kfuB是肺炎克雷伯菌鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)受體，與菌株高毒力密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)K1型肺炎克雷伯菌均攜帶kfuB基因，與kfu基因在K1型菌株檢出率較高一致[19]。rmpA、iucABCD-iutA基因?qū)旮叨玖Α⒏咧滤懒哂兄匾饔茫狙芯堪l(fā)現(xiàn)高黏液K1/K2型菌株感染均攜帶rmpA、iucA、iutA毒力基因，且患者預(yù)后不佳，提示rmpA、iucA、iutA基因可能與K1/K2型菌株的高毒性、高致死性密切相關(guān)[6，20]。本研究SBF-KP菌株entB、fimH、uge、wabG、ureA、ycf基因檢出率大于98.0%，且無菌體液膿液標(biāo)本分離的肺炎克雷伯菌aerobactin、kfuB基因陽性率高于其他無菌體液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，SBF-KP菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物具有不同程度耐藥，對(duì)阿米卡星、替加環(huán)素、碳青霉烯類藥物仍有較好的藥物敏感度；另外SBF-KP菌株攜帶多種毒力因子，且莢膜血清型以K1型、K2型為主，提示臨床應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，結(jié)合菌株藥敏合理選用抗生素，以提高療效及減少高毒力和高耐藥菌株的傳播和流行。