人多梳蛋白2和Ki67在鼻咽癌中的表達及預后意義

吳 梅 侯小娟 再努拉·艾未肉拉 郭小平 唐 亮

鼻咽癌(nasopharygeal carcinoma，NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤。NPC在美國和歐洲發生率較低，在東南亞及中國華南地區高發[1]。NPC的致病因素除環境因素外，還包括遺傳因素和病毒感染等生物因素[2]。有癥狀的NPC患者，就診時多數已是進展期，即使行根治性的放化療，由于腫瘤對放射線抵抗或耐藥導致的局部復發及遠處轉移風險，仍是臨床面臨的棘手問題，也是影響患者生存的主要因素[3]。如何有效區分出高危復發及轉移患者，運用相應的分子靶向藥物是NPC個體化精準治療的新策略[4]。針對鼻咽癌的早期診斷及預后預測的分子標志物研究已經開展，但臨床運用效果還有待驗證[5]。

人多梳蛋白2(human polycomd 2, HPC2)基因又名染色盒同源物4(chromobox homolog 4, CBX4)，是多梳蛋白家族(polycomb group, PcG)的重要成員之一，常與其他PcG分子形成轉錄抑制復合物，發揮其多種生物學功能[6]。同時，HPC2還是一種小泛素分子修飾物(small ubiquitin modifier, SUMO)，對作用底物具有類泛素化調節功能[7]。據相關文獻報道，HPC2/CBX4與多種腫瘤的發生、發展密切相關，但是在鼻咽癌中的表達及臨床預后作用尚未見報道[8]。本研究從臨床樣本著手，運用蛋白印跡及免疫組化法，檢測HPC2在鼻咽癌組織中的表達情況，聯合檢測Ki67，結合臨床病理及隨訪資料判斷其臨床預后價值。

資料與方法

1.一般資料：收集內鏡活檢的8例新鮮鼻咽癌組織標本(男性7例，Ⅱ期1例，Ⅲ期6例；女性1例Ⅲ期)，及同期8例活檢排除腫瘤的鼻咽上皮組織，活檢組織取材后立即放入液氮中凍存備用。收集新疆自治區人民醫院收治的126例鼻咽癌患者，其中男性99例，患者年齡14～88歲，平均年齡49.5歲，女性37例，患者年齡27～73歲，平均年齡51.3歲，均行根治性放射治療。納入標準：①有存檔的組織蠟塊標本，病理學確診為鼻咽癌，無其他惡性腫瘤病史；②所有患者入院前均未接受任何特異性抗腫瘤治療；③患者腫瘤復發和轉移經鼻內鏡活檢，MRI或CT影像檢查證實；④患者因鼻咽癌導致死亡。查閱整理病歷資料，登記隨訪數據。無進展生存定義為從確診之日起至放療后隨訪過程中出現腫瘤局部復發、區域淋巴結或遠處轉移的時間截止，或至末次隨訪時間。總生存定義為從確診之日起至放療后隨訪過程中發生死亡時間截止，或至末次隨訪時間。隨訪數據通過查閱病歷或電話隨訪登記。本研究的實施取得新疆自治區人民醫院醫學倫理學委員會審批同意，患者簽署組織標本使用知情同意書。組織學分類按照2006年世界衛生組織(WHO)頭頸部腫瘤病理學和遺傳學分類標準，TNM分期采用第8版AJCC/UICC鼻咽癌分期系統[9，10]。

2.Wertern blot法：采用RIPA裂解液提內鏡下取活檢組織總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基公司(Cat no.23227)，檢測并配平蛋白濃度。樣品總蛋白用SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，之后轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉，HPC2兔抗人多克隆抗體(Cat no.A302-355A, 1∶2000, 美國Bethyl公司)和β-Actin鼠單克隆抗體(1∶10000)4℃過夜。洗膜后放入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠二抗室溫孵育，再洗膜后ECL(Cat no.P0018F，碧云天公司)化學發光液顯影，凝膠電泳成像儀采集圖像保存。Image lab軟件分析蛋白條帶，將HPC2蛋白印跡條帶的灰度與對應的β-actin的灰度值比較，用該比值表示HPC2蛋白的表達水平。

3.免疫組化染色法：將調取的存檔鼻咽癌組織蠟塊切片并HE染色后，由病理?？漆t生復診審核。審核無誤后，進一步做免疫組化染色，按照SP兩步法標準步驟進行，采用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)恒壓抗原修復，非免疫性山羊血清(中衫金橋)封閉。分別滴加兔抗人特異性HPC2多克隆抗體(貨號：IHC-00668, 美國Bethyl公司，稀釋1∶100)，兔抗人特異性Ki67多克隆抗體(貨號：BS90769，美國Bioworld公司，稀釋1∶200)，PBS作為空白對照，用山羊血清做陰性對照，用已知染色強陽性的人乳腺癌組織切片作為陽性對照。

4.免疫組化結果及評分標準：HPC2采用免疫染色半定量法評分，依據陽性染色細胞的信號強度和陽性細胞所占細胞百分比分別評分[9]。染色強度評分標準：細胞核未出現陽性顯色為0分；細胞核中出現高于背景的淡黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，算出陽性細胞平均百分比并計分：無陽性染色細胞為0分；10%～25%為1分；25%～50%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。由兩位病理醫師采用盲法單獨閱片評分，評分結果不一致的，共同商議后決定最終評分。將上述兩個分值的乘積定為最終分值，所得評分的中位數為6，因此確定≤6分為低表達組，>6分為高表達組。Ki67評分采用腫瘤細胞核陽性染色百分比評分[10]：≤60%分為低表達組，>60%為高表達組。

結 果

1.HPC2蛋白在新鮮組織中表達：將8對新鮮NPC組織和同期體檢的非腫瘤鼻咽上皮組織采用Western blot法檢測，NPC組織中HPC2表達為1.830±0.125，鼻咽上皮組織為0.320±0.065,HPC2在NPC組織中表達明顯高于鼻咽上皮組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 HPC2在鼻咽癌與鼻咽上皮組織中的表達

2.免疫組化法檢測HPC2 及Ki67在鼻咽癌組織中的表達狀態：鼻咽癌組織中HPC2及Ki67蛋白表達的陽性染色，主要定位于腫瘤細胞的胞核，表現為細胞核中存在黃色至褐色的反應顆粒(圖2)。HPC2在鼻咽癌組織中高表達為55.6%(70/126)；低表達為44.4%(56/126)；Ki67在鼻咽癌組織中高表達為61.9%(78/126)；低表達為38.1%(48/126)。

圖2 免疫組化檢測 HPC2和Ki67在鼻咽癌組織中的表達(SP，×400)

3.鼻咽癌組織中HPC2和Ki67表達相關性：每例患者同時檢測HPC2和Ki67兩個指標，根據HPC2和Ki67表達情況，將結果分為低表達組和高表達組。HPC2和Ki67表達相關分析發現，兩指標的表達之間呈正相關(r=0.354，P<0.01，圖3)。

圖3 免疫組化檢測鼻咽癌組織中HPC2和Ki67表達的相關性

4.HPC2免疫表達與臨床病理因素的關系：本組NPC患者的年齡范圍為10～80歲，中位年齡約48歲。截至末次隨訪，所有患者均獲得完整隨訪數據，中位隨訪時間46個月(2～97個月)，復發46例(46/126，36.5%)，遠處轉移13例(13/126，10.3%)，死亡49例(49/126，38.9%)，均為鼻咽癌導致死亡。與HPC2的表達相關的因素有T分期(P=0.012)、N分期(P=0.001)、M分期(P=0.026)、TNM分期(P=0.036)、復發狀態(P=0.000)及Ki67的表達(P=0.000)。不同性別、年齡、族別、吸煙史、病理分型與HPC2的表達無明顯關系(表1)。

表1 HPC2表達與鼻咽癌臨床病理因素的關系

5.HPC2聯合Ki67表達評估鼻咽癌預后：為進一步驗證HPC2和Ki67聯合檢測對鼻咽癌預后風險預測作用，將NPC患者分成3組，即HPC2和Ki67均高表達為第1組；HPC2高表達Ki67低表達組或HPC2低表達Ki67高表達為第2組；HPC2和Ki67均低表達為第3組。3個組的5年無進展生存率分別為18.2%、55.8%和86.7%，無進展生存率比較差異有統計學意義(Log-RankMantel-COX=38.24，P=0.000，圖4A)。3個組的5年總生存率分別為23.1%、62.2%和95.2%，總生存率比較差異有統計學意義(Log-RankMantel-COX=41.43，P=0.000，圖4B)。

圖4 Kaplan-Meier法分析鼻咽癌組織中HPC2與Ki67表達狀態對患者生存的預后作用

討 論

NPC的復發和轉移是多個基因參與的多步驟過程，如何準確預測，選擇合適的干預措施和時機是患者臨床獲益的關鍵。發掘NPC發生、發展過程中主要驅動基因，篩選有效的分子治療靶點是目前研究的焦點問題[11,12]。據相關報道，EBV-DNA是有效的診斷、監測指標，但對于EBV陰性的NPC來說，仍需要有效的替代標志物[13,14]。近年來HPC2/CBX4在腫瘤領域的研究逐漸增多，它既是組成PcG蛋白核心分子，也是一種重要的泛素修飾SUMO E3連接酶。在人類腫瘤中發現HPC2/CBX4具有促癌和抑癌的雙重功能，在腫瘤生物學功能的調控中，其可以和SUMO化底物相互作用也可以通過直接作用于某些轉錄因子的啟動子區域，進而影響其轉錄及功能。

目前，大多數研究結果顯示HPC2/CBX4是一種參與了腫瘤增殖和血管生成的基因，據報道CBX4在肝細胞癌較癌旁組織表達上調，促進細胞周期進展及腫瘤增殖；在乳腺癌中通過Notch1通路促進腫瘤的生長。本研究發現，HPC2/CBX4在鼻咽癌組織的表達較鼻咽非腫瘤組織的表達上調，可能與鼻咽癌的發生、發展有關。異常豐富的血供是惡性腫瘤的重要特征，據相關文獻報道，CBX4 能通過SUMO化修飾調控HIF-1α活性，促進肝細胞癌血管增生。然而CBX4在腫瘤轉移方面的功能不盡一致。最近有報道顯示，CBX4參與了骨肉瘤的轉移，CK1α/CBC4是抑制轉移的有效靶點[15]。在腎透明細胞癌中，CBX4與HDAC1相互作用結合于KLF6基因啟動子抑制轉錄，促進腫瘤生長轉移，CBX4調節BMI1介導肺癌轉移[16，17]。與之相反，在結直腸癌中發現，CBX4卻可以通過募集HDAC3抑制RUNX2轉錄，從而抑制結直腸癌的轉移。

本研究發現，HPC2的表達與鼻咽癌的T、N、M分期及Ki67表達有關，生存分析發現HPC2與 Ki67的表達狀態與腫瘤無進展生存及總生存關系密切，提示HPC2可能參與了NPC的疾病進展。為初步探討HPC2是否與NPC腫瘤細胞增殖有關，免疫組化聯合檢測了Ki67的表達。Ki67蛋白是MKI67基因編碼的蛋白，在增殖細胞核表達，是一種腫瘤增殖指標，反映細胞有絲分裂能力。不同腫瘤中Ki67的預后作用有所不同，有報道稱Ki67與放射線抵抗有關，是局部進展期NPC的不良預后因素[18]。然而，在大樣本量的結腸癌研究發現，Ki67的高表達是良好預后的獨立預測因素。在前列腺癌發現Ki67免疫組化染色測量的腫瘤生長分數是小體積或低級別前列腺術前活檢的獨立預后因素。Ki67表達定量以陽性細胞所占比例評定，通常在腫瘤良惡性鑒別和判斷腫瘤增殖使用。本研究中Ki67高表達占61.9%，表明NPC 的惡性增殖能力強。相關分析顯示，HPC2與Ki67的表達有相關性，且呈正相關，提示HPC2可能與NPC的腫瘤增殖有關。當HPC2與Ki67在NPC組織中均呈高表達時，患者風險最高，無進展生存和總生存率最低；當HPC2與Ki67均呈低表達時，患者風險最低，無進展生存和總生存率最高；當兩者表達不一致時，患者無進展生存和總生存率介于兩者之間，屬中度風險。因此，聯合檢測HPC2與Ki67的表達，能有效將不同風險的NPC患者區分開來，供臨床治療做決策，尤其對預后最差的和中度風險的患者及時監測，盡早干預，改善生活質量，提高生存率。本研究的局限性在于樣本量還不夠大，而且NPC早期的病例數偏少。因此，HPC2在早期NPC的應用還可以加大早期病例樣本數進行深入分析。

綜上所述，HPC2表達與NPC腫瘤的大小、侵犯范圍、淋巴結轉移狀態和是否合并遠處轉移的分期因素密切相關，其高表達提示腫瘤進展及NPC預后不良，與Ki67聯合檢測利于準確判斷預后風險及臨床個體化干預。