HPV16-E6、E7 蛋白在宮頸癌組織中的表達與病理特征的相關性

阮立通，邵志葉，錢鋼

宮頸癌（CC）是危害我國女性健康的主要婦科疾病，是第二大惡性腫瘤疾病[1]。近年來，宮頸病變、宮頸癌與人乳頭瘤病毒（HPV）感染間存在緊密關聯已成為學界共識[1-3]。其中高危型HPV（HRHPV）感染更是宮頸癌的獨立危險因素，HPV-16 為感染率較高的HR-HPV亞型，其入侵人體后可導致正常細胞化生，同時其可刺激相關致癌基因生成 HPV16-E6、HPV16-E7 致癌蛋白，引起機體細胞周期調節蛋白（CCRP）功能、表達水平異常，增加感染者宮頸癌變風險。隨著醫學檢測技術及設備的發展，HPV16-E6及E7 蛋白的臨床檢測成為可能，通過對E6、E7 癌蛋白的表達水平與宮頸疾病間的相關性進行分析總結，以得出科學有效的診療、防控方案對臨床宮頸疾病患者而言具有重要意義[3]。現階段關于E6、E7 癌蛋白在宮頸疾病中的作用機制尚不完全明確，本研究探討HPV16-E6 及E7 蛋白與宮頸病變、宮頸癌的相關性，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月至2020 年 1 月浙江省慈溪市婦幼保健院147 例宮頸疾病患者，根據病理學檢查結果，將 56 例 CC 患者設為 A 組，43 例高度鱗狀上皮內病變（HSIL）患者設為B組，48 例低度鱗狀上皮內病變（LSIL）患者設為C 組。納入標準：（1）A 組符合FIGO《2018 癌癥報告：宮頸癌新分期及診治指南》[4]中 CC 診斷標準；（2）B、C 組患者符合《宮頸癌及癌前病變規范化診療指南》[5]中 CIN 診斷標準；（3）均經陰道鏡下活檢證實；（4）基本生命體征穩定，肢體挪動、5 m 內行走等基本活動無礙；（5）自愿簽署知情告知書。排除標準：（1）合并嚴重心、肝、腎等臟器功能損傷或嚴重水電解質紊亂、急性感染、機械性損傷、血液系統、內分泌系統疾病，可能對本研究造成干擾者；（2）存在嚴重意識障礙、情感障礙或精神病史，無法配合基本研究調查者。其中A 組年齡35 ～76 歲，平均（43.4±4.3）歲；體質量指數（BMI）18 ～27 kg/m2，平均（23.16±3.34）kg/m2；FIGO 分期：Ⅰ期 20 例，Ⅱ期 23例，Ⅲ期 13 例；鱗癌 37 例，腺癌 19 例。B組年齡36～75歲，平均（44.2±4.2）歲；BMI 18 ～ 26 kg/m2，平均（23.25±3.28）kg/m2；CIN Ⅱ期 29 例，CIN Ⅲ期 14 例。C組年齡33～76歲，平均（43.6±4.3）歲；BMI 19 ～ 27 kg/m2，平均（23.43±3.35）kg/m2；均為CINⅠ期。本研究經醫學倫理委員會批準，3 組一般資料差異無統計學意義（P ＞ 0.05），有可比性。

1.2 方法 檢查前3 d 應禁止性生活，檢查期間避開經期，采用電子陰道鏡，擴陰并充分暴露宮頸后將探頭置入受檢者陰道內，對子宮頸形態、顏色、有無贅生物等進行詳細檢查，采集受檢者病理組織樣本用于相關蛋白測定及病理學檢查，本研究以病理學檢查結果作為診斷“金標準”。

HPV16-E6 及 E7 蛋白檢測：以免疫組化染色法（SP）染色，將病理組織樣本制作成石蠟切片，行脫蠟至水操作后于25℃溫度下以0.3% 濃度過氧化氫溶液浸泡10 ～15 min，以蒸餾水清洗后進行熱抗原修復，而后于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中反復清洗3 次，滴加5%濃度牛血清白蛋白（BSA）后于25℃溫度下孵育15 min，加入一抗稀釋液（Leica Biosystems Newcastle Ltd，500 ml）后于 4℃溫度下放置過夜；次日取出組織樣本于25℃溫度下放置30 min 后以PBS 清洗3 次，加入D-生物素（西寶生物科技，5 g）以標記二抗稀釋液（Leica Biosystems Newcastle Ltd，100 ml）后于 37℃溫度下孵育30 min，以PBS 清洗 3 次，加入鏈霉親和素（陜西新研博美生物科技，5ml）復合體后于37 ℃溫度下孵育20 min，以 PBS 清洗 3 次，以 DAB 染色液（上海歌凡生物科技，100 ml）初染，以蘇木素染色液（上海歌凡生物科技，100 ml）復染，脫水、透明處理后封片；置于顯微鏡下觀察染色情況并控制反應進度，再次染色、脫水、透明處理后封片。分別以已知CC 病例、PBS 替代一抗做陽性、陰性對照，于光學顯微鏡下觀察細胞核、細胞質呈棕色的細胞數量，染色細胞數＞10%即為陽性。

1.3 觀察指標 對比3 組 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率；記錄A 組臨床資料，包括淋巴結轉移、腫瘤最大徑、臨床分期、病理類型、宮旁浸潤等病理特征。

1.4 統計方法 采用SPSS 22.0 進行數據分析，計量資料分別平均數±標準差表示，采用t 檢驗；計數資料采用2檢驗；相關性分析采用 Pearson 相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率比較 A組HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于B 組、C 組（2≥26.184，均 P ＜ 0.05）；B組HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于C 組（2=23.843/35.707，均P＜ 0.05），見表 1。

2.2 HPV16-E6、E7 蛋白陽性與宮頸癌病理特征的相關性 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率與CC 患者年齡、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、組織學分級間差異無統計學意義（均P＞0.05），與臨床分期、宮旁浸潤、病理類型間差異有統計學意義（均P ＜ 0.05），見表 2。

2.3 HPV16-E6 陽性與 HPV16-E7 陽性的相關性 CC 患者HPV16-E6 陽性與HPV16-E7 陽性呈正相關（r=0.542，P ＜0.05），見表 3。

3 討論

CC屬于上皮腫瘤，是臨床常見的女性惡性腫瘤，發病機制尚未明確，研究證實其或由慢性宮頸炎癥、宮頸腫瘤在環境、遺傳、病理性因素等多因素作用下發展而來。近年來，越來越多研究[6-7]證實了宮頸病變與HPV 感染間存在關聯性，CC 患者中HPV 感染率更是高達90%。由于宮頸病變與HPV 間的密切關聯，臨床預防宮頸癌等宮頸病變主要以預防HPV 感染為主，雖然目前已有效果良好的HPV 感染預防疫苗，但現階段HPV疫苗較稀缺且價格較昂貴，難以滿足廣大女性的接種需求。盡管疫苗防治在短期內難以實現，但隨著基因診斷技術與設備的不斷進步，方便快捷的HPV 基因檢測已逐漸應用于各大醫院，有助于臨床對CC、宮頸病變與HPV 感染間的關聯性作進一步研究。HPV16 是臨床感染率較高的HR-HPV 亞型之一，當HPV16侵入人體后可激活、刺激HPV16E6 等相關癌基因合成E6、E7 致癌蛋白，HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白可與 CCRP 特異性結合進而影響人體細胞調節周期異常，使細胞分化增殖、分化進程發生變化，進而增加女性感染者CC 發生概率。

表13 組 HPV16-E6、E7 蛋白陽性率對比 例（%）

CC 患者卵巢功能遭到損害時垂體會反饋性的分泌促卵泡激素（FSH），在FSH 與 HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白的多重作用下，患者機體內多種細胞因子的表達水平結皆可出現異常[8]。如HPV16-E6蛋白可促進血管內皮生長因子（VEGF）的分泌合成，VEGF 可誘導血管新生，促進血管內皮細胞分化、增生及浸潤，進而增加CC 患者癌細胞增殖、轉移風險。本研究中CC患者HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于 HSIL、LSIL 患者，而 HSIL 患者HPV16-E6、E7 蛋白陽性率高于 LSIL 患者，與岳晚俠等[9]結果對應。表明HPV16-E6、E7 蛋白陽性或與患者宮頸病變程度有關，患者宮頸病變程度越高、宮頸損傷越嚴重則組織中HPV16-E6、E7 蛋白表達水平越高，這或是由于HPV16-E7 蛋白可影響人體關鍵抑癌基因-P53 基因的信號轉錄，進而使其對細胞增殖的抑制功能減弱，隨著患者宮頸病變程度的提高，P53 基因的抑癌功能則逐漸喪失，進而引發CC。本研究結果中HPV16-E6、E7 蛋白陽性率與臨床分期、宮旁浸潤、病理類型間差異有統計學意義，也佐證了這一觀點。本研究還顯示，CC 患者HPV16-E6 陽性與 HPV16-E7 陽性呈正相關，這表明 HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白表達可相互促進。這可能是由于 H PV16-E6 蛋白可增加外源性DNA 整合、誘變進程及風險，還可引起端粒酶逆轉錄酶（TERT）的mRNA 水平上升，導致機體內正常細胞永生化，影響細胞周期調節；而HPV16-E7 蛋白22 ～226 位氨基酸為人體重要細胞周期調節因子-成視網膜母細胞瘤蛋白（PRB）的結合位點，在HPV16-E7 蛋白作用下可使細胞周期調控異常。

表3 CC 患者HPV16-E6 陽性與HPV16-E7 陽性的相關性