腹水草水提液通過調(diào)控NF—κB信號通路抗乙醇對GES—1細胞的損傷＊

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053）

胃潰瘍的發(fā)生與胃粘膜上皮細胞的損傷有著密切關(guān)系。當(dāng)胃粘膜受到嚴重損傷時，胃粘膜上皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能被破壞，導(dǎo)致細胞增殖和死亡的失衡，進而導(dǎo)致胃潰瘍、胃炎等疾病的發(fā)生[1]。腹水草（Veronicastrum axillare）為玄參科腹水草屬植物，具有逐水消腫，清熱解毒，治臌脹、小便不利、大便不通等功效[2]。前期研究表明，其水提液顯著降低無水乙醇對大鼠胃粘膜的損傷[3]。本文采用體外培養(yǎng)人胃上皮細胞GES-1細胞制備乙醇損傷細胞模型，研究腹水草水提液對GES-1細胞NF-κB信號通路的調(diào)控作用，為明確腹水草水提液抗胃潰瘍的分子機制提供實驗依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

腹水草水提液和雷尼替丁混懸液的制備方法見文獻[3]。GES-1細胞株購自南京市科佰生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司；TNF-α、TNFR-1、IKBα、IKKβ和NF-κB ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；Trizol試劑、PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 GES-1細胞的分組及造模

GES-1細胞的培養(yǎng)方法見文獻[4]。取對數(shù)生長期的細胞，以1×106個/ml接種于6孔板，每孔2ml，培養(yǎng)24h后，棄原培養(yǎng)基，將細胞分為正常組、模型組、雷尼替丁組（45μg/ml）、腹水草高（80μg/ml）、中（40μg/ml）、低（20μg/ml）劑量組，每組6個復(fù)孔。正常組、模型組加入2ml培養(yǎng)基。雷尼替丁組、腹水草高、中、低劑量組分別加入含雷尼替丁、腹水草各濃度的培養(yǎng)基2ml。培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)基，正常組加2ml培養(yǎng)基，其余各組每孔加入2ml含5%乙醇的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4h后，上清液轉(zhuǎn)移到EP管中，3000r/min，離心10min，上清液用于檢測TNF-α蛋白的表達水平。細胞板中的細胞和EP管中的沉淀用于細胞總蛋白和總RNA的提取。

1.2.2 ELISA檢測NF-κB信號通路關(guān)鍵因子蛋白的表達

將各組細胞收集細胞于EP管中，1000r/min離心5min，去上清。沉淀中加入150μL含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000r/min離心10min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。雙抗體夾心ELISA檢測GES-1細胞上清液中TNF-α和胞內(nèi)TNFR-1、IκBα、IKKβ及NF-κB蛋白的表達量。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測NF-κB信號通路關(guān)鍵因子mRNA的表達

采用Trizol試劑提取總RNA，取0.5μg RNA采用Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit擴增目的基因cDNA片段，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃5s，60℃30s，共40個循環(huán)，根據(jù)2-ΔΔCt法，以β-actin為內(nèi)參基因分析 mRNA相對表達量。引物序列及產(chǎn)物大小見文獻[4]。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，單因素方差分析組間差異，LSD法兩兩比較，p＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

由圖1可知，與正常組相比，模型組中TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB蛋白和mRNA表達量顯著升高（p＜0.01），雷尼替丁組及腹水草低、中劑量組顯著上調(diào)TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB mRNA的表達（p＜0.05或p＜0.01），腹水草水提液中、高濃度組IκBα蛋白表達量升高（p＜0.05或p＜0.01）；與模型組相比，雷尼替丁及腹水草各劑量均顯著下調(diào) TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB蛋白和mRNA表達水平（p＜0.05或p＜0.01），且呈劑量依賴性。

圖1 腹水草水提液對GES-1細胞NF-κB信號通路關(guān)鍵因子表達的影響

3.討論

酒精性胃粘膜損傷性疾病是指由于大量飲酒引起胃粘膜損傷而誘發(fā)的疾病，如胃潰瘍、胃出血等[1]。乙醇可通過脫水作用（凝固組織蛋白）、中性粒細胞浸潤、氧自由基、前列腺素、胃粘膜屏障、胃酸分泌、粘膜微循環(huán)等途徑損傷胃組織[4]，還可誘導(dǎo)細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和細胞凋亡[1]。炎癥反應(yīng)和炎癥細胞浸潤胃粘膜后，釋放出的炎性細胞因子能加重胃潰瘍的發(fā)生，過度使用乙醇可激活內(nèi)在免疫機制，使得促炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β水平升高[5]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，腹水草水提液各組GES-1細胞中 TNF-α、TNFR-1、NF-κB、IκBα、IKKβ 蛋白和mRNA的表達量均顯著降低，表明腹水草水提液可通過轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控NF-κB信號通路來抑制乙醇誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而保護GES-1細胞。這一結(jié)果與項目組前期用腹水草含藥血清進行體外藥效實驗的結(jié)果一致[4]。

在本研究中，我們分別檢測了細胞培養(yǎng)上清中TNF-α的表達水平和細胞中TNFR-1、NF-κB、IκBα、IKKβ的表達水平，這主要是由于TNF-α分泌到細胞外，而其余蛋白為胞內(nèi)蛋白的原因。此外，當(dāng)用乙醇處理細胞后，大量細胞出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，我們在收集細胞的時候通過離心回收漂浮細胞以減少實驗誤差，起到了良好的效果。這為腹水草的臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的理論與實驗依據(jù)。