Pall Supor. EBV過濾器用于20%人血白蛋白注射劑除菌過濾的驗證

徐華軍

摘 要：為驗證Pall Supor EBV過濾器（0.2 μm過濾精度）用于20%人血白蛋白注射劑達到除菌過濾的目的，在少量工藝流體中接種缺陷假單胞菌（B. diminuta）ATCC 19146TM后加入循環的20%人血白蛋白注射劑中。挑戰溶液在最差工藝條件下通過待測過濾器，挑戰水平應≥1.0×107 CFU/cm2有效過濾面積（CFU為菌落形成單位），分析濾出液是否含有缺陷假單胞菌。結果發現，濾出液不含有缺陷假單胞菌。得出的結論為：Pall Supor EBV過濾器（0.2 μm過濾精度）適用于20%人血白蛋白注射劑的除菌過濾。

關鍵詞：人血白蛋白;EBV過濾器;除菌過濾;驗證

20%人血白蛋白注射劑是非最終滅菌的無菌生物制品，其中最終灌裝生產工藝需要使用0.2 μm過濾精度的除菌過濾器進行除菌過濾，以達到無菌的質量標準。本次試驗采用的方法是：少量工藝流體中接種缺陷假單胞菌（Brevundimonas diminuta，B. diminuta）ATCC 19146TM后加入循環的20%人血白蛋白注射劑中。挑戰溶液在最差工藝條件下通過待測過濾器，挑戰水平應≥1.0×107 CFU/cm2有效過濾面積（CFU為菌落形成單位），分析濾出液是否含有缺陷假單胞菌。本試驗旨在驗證Pall Supor EBV過濾器 ? （0.2 μm過濾精度）用于20%人血白蛋白注射劑的除菌過濾效果。

1 ? ?材料和方法

1.1 ?材料與儀器

1.1.1 ?材料

白蛋白注射液（質量分數為20%，廣西冠峰生物制品有限公司），缺陷假單胞菌（B. diminuta）ATCC 19146TM ? （PW 081815，美國菌種保藏中心）。

1.1.2 ?主要儀器

除菌過濾器：0.2 μm過濾精度的Supor EBV濾膜（FTKEBV，美國Pall公司），0.45 μm過濾精度的Supor 450濾膜（型號60173，美國Pall公司）。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?微生物準備和挑戰用菌懸液

缺陷假單胞菌事先通過大規模培養至穩定期，菌體 （PW 081815）以冷凍狀態保存，使用前制備成挑戰用菌懸液。由于工藝流體對缺陷假單胞菌具有非殺菌性作用，將缺陷假單胞菌以3.1×107 CFU/mL的細菌濃度懸浮于少量的20%人血白蛋白注射劑中，然后加入循環的20%人血白蛋白注射劑中（約0.5 mL/min）挑戰300 min，以達到適宜的挑戰濃度。

1.2.2 ?儀器準備

（1）采用Pall進行挑戰。待測濾膜與工藝過濾器（ABIEBV7PH4）所含的濾膜具有相同材質，在125 ℃下高壓滅菌60 min。然后將濾膜安裝在適當的過濾器夾持器中，有效過濾面積為13.8 cm2。每個夾持器安裝一個待測濾膜或對照濾膜。為確認濾膜的過濾精度及完整性，使用前對每個過濾器進行泡點測試。

（2）為了確認缺陷假單胞菌的單分散性以及是否能夠透過0.45 μm過濾精度濾膜，用Pall 0.45 μm過濾精度的Supor 450濾膜（60173）作為對照。

（3）用一定量的菌懸液挑戰待測過濾器，每個過濾器的最終挑戰水平應大于1.0×107 CFU/cm2有效過濾面積。將接種后的工藝流體逐漸加入循環通過待測和對照過濾器的工藝流體中。

（4）挑戰試驗操作參數。驗證的首要目的是證明20%人血白蛋白注射劑在模擬實際生產工藝的挑戰條件下不會影響Pall 0.2 μm過濾精度的Supor EBV濾膜對缺陷假單胞菌的完全截留[1]。為達到該目的，在模擬最惡劣工藝參數的試驗條件下，將工藝流體循環通過待測過濾器和對照過濾器，同時將缺陷假單胞菌懸浮在少量工藝流體中，以大約0.5 mL/min的速度加入循環系統。

（5）在裝有待測濾膜的夾持器下游，無菌連接一個裝有Pall 0.2 μm過濾精度的Supor 200截留濾膜（66549）的夾持器。

（6）用懸浮于無菌20%人血白蛋白注射劑中的缺陷假單胞菌進行挑戰。通過待測過濾器上下游的壓力表來監測壓差。挑戰結束后，用3 000 mL無菌水沖洗截留過濾器，然后取出截留濾膜，置于大豆胰酶瓊脂（TSA）平板上培養。

（7）挑戰前和挑戰后分別從菌懸液中取樣檢測活菌濃度，采用最低的菌濃度計算挑戰濃度。

（8）平板均在（30±2）℃下培養至少7天。挑戰后需對待測過濾器進行泡點測試。

2 ? ?結果與分析

2.1 ?工藝和試驗參數

根據生產工藝，挑戰試驗在15～16 psi（0.10～0.11 MPa）下維持122 min、在29.0～30.5 psi（0.20～0.21 MPa）下維持10 min，其余時間低速循環，壓差維持在7～9 psi（0.05～0.06 MPa）。

2.2 ?挑戰前后的完整性測試數據

挑戰前后的完整性測試數據如表1所示。

2.3 ?缺陷假單胞菌挑戰用量

缺陷假單胞菌挑戰用量如表2所示。

總挑戰菌數（CFU）=較低的挑戰菌濃度（CFU/mL）×菌懸液用量（mL）（1）

挑戰濃度（CFU/mL）=總挑戰菌數（CFU）/總批量（mL）（2）

2.4 ?待測過濾器和對照過濾器的挑戰參數及細菌截留數據

待測過濾器和對照過濾器的挑戰參數及細菌截留數據如表3所示。

總挑戰菌數（CFU）=挑戰濃度（CFU/mL）×批量（mL）（3）

挑戰水平（CFU/cm2）=總挑戰菌數（CFU）/有效過濾面積（EFA）（4）

截留量=總挑戰菌數/總透過菌數（5）

Pall 0.2 μm過濾精度的Supor EBV除菌級濾膜（FTKEBV）截留了100%的挑戰用微生物，表明在本研究所述的最惡劣試驗條件下，該類濾膜可以完全截留缺陷假單胞菌。作為對照，0.45 μm過濾精度的Pall Supor 450對照濾膜（60173）允許缺陷假單胞菌透過到濾出液中，符合細菌截留試驗的接受標準。

2.5 ?細菌挑戰結果

在細菌挑戰階段，壓差變化范圍在7.0～30.5 psi，流速變化范圍在10～54 mL/min。

2.6 ?接受標準

驗證試驗符合所有接受標準，如表4所示。

3 ? ?結語

Pall 0.2 μm過濾精度的Supor EBV除菌級過濾器可完全截留懸浮于20%人血白蛋白注射劑中的缺陷假單胞菌，挑戰水平不低于8.7×107 CFU/cm2有效過濾面積。用20%人血白蛋白注射劑模擬生產工藝中的壓差、時間和批量進行細菌挑戰。根據試驗結果，Pall Supor EBV除菌級過濾器在本試驗所述的參數下，適用于20%人血白蛋白注射劑的除菌過濾。

[參考文獻]

[1]MARTIN J.PDA technical report No.26“Sterilizing Filtration of Liquids”[EB/OL].（2007-06-13）[2021-02-20].https：//www.docin.com/p-566612727.html.