利用玉米秸稈廉價生產鼠李糖脂的研究

張媛 常思源

摘 要：鼠李糖脂是一種重要的生物表面活性劑，在石油開采、農業、醫藥、化妝品及生物降解等不同領域有著廣泛的應用。鼠李糖脂低產量、高成本的劣勢極大地限制了其更為廣泛的應用。研究銅綠假單胞菌PC-1以廉價的玉米秸稈稀酸解液生產鼠李糖脂的工藝，進一步對鼠李糖脂的發酵培養氮源和發酵條件進行優化，當玉米秸稈稀酸解液和含糖濃度NaNO3分別設定為20.0 g/L和15.0 g/L時，鼠李糖脂產量可達19.3 g/L。

關鍵詞：鼠李糖脂;銅綠假單胞菌PC-1;玉米秸稈稀酸解液

在中國，每年玉米秸稈的產量約有3.5億t，但長期以來僅有小部分的玉米秸稈用作飼養牲畜的粗飼料，大部分玉米秸稈被用作燃料或者直接焚燒，這不僅是資源的巨大浪費，也會對環境造成巨大污染[1]。鼠李糖脂（Rhamnolipid）是由假單胞菌或伯克氏菌類產生的一種生物代謝性質的表面活性劑[2]。親水基團主要由1～2個鼠李糖環構成，憎水基團則由1～2個不同碳鏈長度的脂肪酸構成。鼠李糖脂具有乳化、增溶、分散、凝聚和降低界面張力等特性，已應用于石油開采、生物降解、食品保鮮劑等領域[3-5]。鼠李糖脂通常以微生物發酵制得，然而鼠李糖脂生產成本過高以及產率低，限制了其規模化生產及應用[6]。

玉米秸稈作為一種廉價易得的碳源，以其為原料生物合成鼠李糖脂，不僅可以有效降低生產鼠李糖脂的成本，而且降低了玉米秸稈的治理成本，實現了玉米秸稈的資源化利用。本研究以本實驗室保存的菌株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1為出發菌株，以玉米秸稈稀酸解液為碳源生產鼠李糖脂，并優化了氮源種類，旨在建立鼠李糖脂的廉價生產工藝。

1 ? ?材料與方法

1.1 ?培養基與菌株

銅綠假單胞菌PC-1由本實驗室分離篩選獲得。

平板培養基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L。

初始發酵產酶培養基：Ca（OH）2中和預處理的玉米秸稈酸解液，NaNO3 0.5 g/L，KH2PO4 0.10 g/L，Na2HPO4·12H2O ?0.10 g/L，MgSO4 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，CaCl2·2H2O ?0.01 g/L。

1.2 ?玉米秸稈酸解液的酸解獲取

先將玉米秸稈放置在烘箱中進行烘干處理，取出后研磨處理成直徑約為100目的顆粒。稱取600 g玉米秸稈顆粒，將玉米秸稈顆粒與2%的稀硫酸混合（固液比為1∶10）后，121 ℃酸解1 h，待冷卻后使用紗布過濾，去除玉米秸稈殘渣后的清液即為玉米秸稈酸解液。

酸解過程中會產生甲酸、乙酸以及糠醛等抑菌成分，且酸解液的pH比較低，使用Ca（OH）2將玉米芯酸解液的pH直接調節到10，再回調至6.5。去除沉淀CaSO4后的酸解液直接用于后續的發酵。

1.3 ?銅綠假單胞菌PC-1發酵生產鼠李糖脂的氮源優化

采用發酵初始培養基，以NaNO3、NH4Cl、NH4NO3和（NH4）2SO4為無機氮源（初始添加量為5 g/L），以酵母粉、牛肉膏及蛋白胨為有機氮源（初始添加量為10 g/L），分析氮源種類對發酵的影響。

1.4 ?鼠李糖脂含量檢測

采用苔黑酚法測定鼠李糖脂含量[7]。鼠李糖脂基在濃硫酸作用下脫水形成糠醛類化合物，與地衣酚結合顯藍綠色，可用分光光度計測定421 nm處的吸收值。

2 ? ?結果與討論

2.1 ?玉米秸稈稀酸解液各組分測定

將玉米秸稈稀酸解液中和處理后的樣品參照美國國家可再生能源實驗的方法，采用高效液相色譜儀測定各組分，結果如表1所示。玉米秸稈稀酸解液以Ca（OH）2中和工藝處理后，總糖質量濃度約為27.8 g/L，其中，木糖質量濃度約為18.1 g/L，占總糖組分的65%左右，培養基中還含有阿拉伯糖6.5 g/L、葡萄糖1.6 g/L，乙酸約4.7 g/L，甲酸、糠醛等抑制物組分未檢出。

2.2 ?玉米秸稈稀酸解液發酵生產鼠李糖脂

將Ca（OH）2中和的玉米秸稈酸解液的總還原糖質量濃度調整到20 g/L作為碳源，發酵培養5 d，結果如圖1所示。當以酸解液為碳源時，鼠李糖脂產量為5.7 g/L;由于酸解液中主要含有木糖和阿拉伯糖，考察以木糖和阿拉伯糖為碳源對鼠李糖脂產量的影響。在同樣條件下，木糖產量（6.4 g/L）顯然優于阿拉伯糖（5.1 g/L）。不同碳源對菌株PC-1的生長量也有影響，以木糖為碳源的生長量最高。這些結果說明，銅綠假單胞菌PC-1具有良好的木糖代謝能力，能以廉價的玉米秸稈酸解液生長并生產鼠李糖脂。故玉米秸稈酸解液可作為菌株PC-1生產鼠李糖脂的碳源。

2.3 ?銅綠假單胞菌PC-1生產鼠李糖脂發酵條件優化

2.3.1 ?氮源對菌株PC-1生產鼠李糖脂的影響

氮源也是微生物合成代謝產物重要營養物質。本研究考察NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4、酵母粉、牛肉膏及蛋白胨等7種氮源對菌株PC-1產鼠李糖脂的影響，結果如圖2所示，NaNO3最有利于鼠李糖脂的合成，蛋白胨對菌體生長最為有利。以NaNO3為氮源時，鼠李糖脂產量最高達12.4 g/L，而以NH4Cl、NH4NO3和（NH4）2SO4作為氮源時，菌株PC-1產的鼠李糖脂產量較低，可能該菌株不善于利用氨類氮源。此外，有機氮源更有利于菌體PC-1的生長，而無機氮源則更有利于產物積累。故選用NaNO3為菌株PC-1生產鼠李糖脂的氮源。

2.3.2 ?碳氮比對菌株PC-1生產鼠李糖脂的影響

碳氮比（C/N）對微生物的生長和代謝有著重要影響，在上述最佳碳源氮源下，進一步調整碳源氮源的投加比，以10 g/L NaNO3為氮源，調節酸解液含糖質量濃度分別為10、20、30、40、50 g/L，發現酸解液含糖質量濃度為30 g/L時，菌株PC-1的鼠李糖脂產量最高達17.7 g/L，故確定酸解液含糖質量濃度最佳為30 g/L。控制酸解液含糖質量濃度為 ? ? 30 g/L，調節NaNO3的質量濃度分別為10、15、20、25、30 g/L，測得NaNO3為15 g/L時，菌株PC-1的鼠李糖脂產量達到最大值18.5 g/L。因此，在后續研究中，培養基酸解液含糖質量濃度及NaNO3分別設定為20.0 g/L和15.0 g/L。

3 ? ?結語

以實驗室自行篩選保存的銅綠假單胞菌PC-1為出發菌株，利用廉價的玉米秸稈稀酸解液為碳源生產生物表面活性劑鼠李糖脂，進一步對鼠李糖脂的發酵培養氮源進行優化。當玉米秸稈稀酸解液含糖質量濃度和NaNO3質量濃度分別設定為20.0 g/L和15.0 g/L時，鼠李糖脂產量可達19.3 g/L。

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Study on ?cost-effective production of rhamnolipid from biomass waste by fermentation

Zhang Yuan， Chang Siyuan

（1.Nanjing Zoonbio Biotechnology Co. Ltd.， R&D Department， Nanjing 210034， China; 2.College of Biology and

Environment， Nanjing Polytechnic Institute， Nanjing 210048， China）

Abstract：Rhamnolipid is an important biosurfactant， which is widely used in petroleum exploitation， agriculture， medicine， cosmetics and biodegradation. The low yield and high cost of rhamnolipid limit its wider application. In this study， the technology of rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa PC-1 was studied. Furthermore， the nitrogen source and fermentation conditions of rhamnolipid were optimized. When the mass concentrantions of corn straw dilute acid hydrolysate and NaNO3 were set at 20.0 g/L and 15.0 g/L respectively， the rhamnolipid yield was 19.3 g/L.

Key words：rhamnolipid; Pseudomonas aeruginosa PC-1; corn straw dilute acid hydrolysate

基金項目：南京科技職業學院校級科研課題（NHKY-2019-18）

作者簡介：張媛（1986— ），女，工程師，碩士;研究方向：生物醫藥。

通信作者：常思源（1986— ），男，講師，博士;研究方向：生物產品分離提取。