通關藤提取物對HepG2肝癌細胞增殖抑制的影響*

黃爭榮 林錦培 王 泳 賴義勤 張劭琴 何火聰

原發性肝癌(簡稱肝癌)是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在我國發病率居惡性腫瘤的第4位，腫瘤相關死亡第2位[1]。目前原發性肝癌的治療手段有手術、介入、靶向等，但由于肝癌起病隱匿，惡性程度高，病程短，臨床上較難早期發現，確診時往往病情已進入晚期，無法進行根治性治療，而中醫藥在肝癌綜合治療中具有日益重要的地位。既往研究[2，3]發現，通關藤對肝癌具有良好的抗腫瘤療效，能夠改善患者生活質量。因此，本研究就該藥物的抗腫瘤作用作進一步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑MTE購于南京圣和藥業有限公司(商品名：消癌平注射液，國藥準字Z20025868，生藥濃度為2.5 g/ml)；胎牛血、胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培養基(Hyclone公司，美國)；二甲亞砜(DMSO)(Gibco公司，美國)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(索萊寶科技有限公司，北京)；碘化丙錠、細胞周期試劑盒(Becton Dickinson公司，美國)。

1.2 主要儀器流式細胞儀(Becton Dickinson公司,美國)；IX70倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；冷凍離心機(Thermo Electron 公司，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化設備公司，江蘇)；CO2培養箱(Thermo Electron公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養人肝癌細胞HepG2系由福建省腫瘤醫院生物放射研究室傳代培養。將HepG2肝癌細胞復蘇后，懸浮生長于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。取狀態良好、處于對數生長期HepG2細胞進行實驗。

1.3.2 MTT法檢測MTE對HepG2細胞增殖的作用將HepG2細胞以密度為2×104個細胞/孔接種于96孔培養板，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h待細胞貼壁，分別加入不同濃度的MTE (7.5 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、60 mg/ml)，同時設空白對照組和調零組，每組3個復孔，置CO2培養箱中繼續培養12 h、24 h、48h。實驗終止前4 h各加入MTT溶液10μl/孔，再置培養箱中培養4 h后，吸去培養孔內培養液。每孔加入100 μl DMSO，放置搖床低速振蕩10 min，待產生的藍紫色結晶溶解后，用酶標儀檢測各孔OD值(490 nm)。計算抑制率：抑制率=(1-藥物處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.3 克隆形成實驗觀察MTE對HepG2肝癌細胞增殖的作用取對數生長期HepG2細胞，用0.25%胰酶消化并用吸管吹打成單個細胞，分別接種于含完全培養液的6孔板中，200個細胞/孔。輕輕搖動，使細胞分散均勻，24 h細胞貼壁后吸棄培養基，設置實驗組和空白對照組，實驗組各孔分別加濃度為15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml MTE含藥培養基，每孔2 ml，對照組加等體積培養基。置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱培養48 h后，吸取培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，用純甲醇固定細胞，加適量姬姆薩色素染細胞核10 min，然后用清水緩慢洗去染色液，干燥。將6孔板底部貼一張帶網格的透明膠片，倒置顯微鏡下計數克隆，含50個細胞以上形成的細胞集落為1個克隆，并計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.3.4 流式細胞術檢測MTE對HepG2肝癌細胞細胞周期的影響將細胞濃度為5×104/ml HepG2細胞接種于25 ml培養瓶，常規培養24 h后，加入終濃度為15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml MTE，設空白對照組。作用24 h后取出細胞，用將0.25%胰蛋白酶消化，收集1×106/ml細胞，用0.01 mol/L PBS pH 7.2清洗，離心(1500 rpm，5 min)，共2次。用300 μl PBS重懸，然后加入700 μl預冷的無水乙醇，固定30 min后，用PBS洗滌細胞2次。每管加入200 μl碘化丙錠(含100 μg/ml RNase)染色30 min，上流式細胞儀分析、檢測。

1.3.5 統計學方法實驗每組細胞平行重復3次。實驗數據應用SPSS 24.0統計軟件進行分析，采用單因素方差分析比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTE對HepG2肝癌細胞增殖的影響經不同濃度藥物作用24 h，各劑量組MTE對HepG2肝癌細胞增殖均表現明顯抑制作用，抑制率隨藥物濃度的增加而增加，呈劑量與時間依賴效應關系。5個不同濃度MTE組對HepG2肝癌細胞抑制作用均隨時間延長而增強，呈時間依賴效應關系。見圖1。

圖1 MTE對HepG2肝癌細胞增殖的影響

2.2 MTE對HepG2肝癌細胞克隆形成的影響HepG2肝癌細胞經不同濃度MTE作用后，細胞克隆能力明顯下降，克隆形成數目顯著低于空白對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，而且形成的細胞克隆直徑也小于空白對照組。見圖2、表1。

注：A: 0 mg/ml組, B:15 mg/ml組, C:20 mg/ml組, D:30 mg/ml組

表1 MTE對HepG2肝癌細胞克隆形成的影響

2.3 MTE對HepG2肝癌細胞周期的影響流式細胞術檢測發現，隨著MTE作用濃度的增加，G1期細胞所占的比例逐漸上升，S期細胞所占的比例逐漸下降，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 MTE對HepG2肝癌細胞周期的影響

表2 MTE對HepG2肝癌細胞周期的影響

3 討論

通關藤為蘿藦科牛奶菜屬植物，最早載于《滇南本草》，主要分布于云南、貴州、廣西等亞熱帶地區，味苦、微甘，性涼，具有清熱解毒、止咳平喘、祛痰等功效[4]。近年來，對通關藤的抗腫瘤作用研究已引起廣泛的關注，越來越多研究表明通關藤具有較強的抗腫瘤生物活性[5-7]。

本研究發現，經MTE作用后HepG2肝癌細胞生長速度明顯減慢，各濃度的MTE對HepG2肝癌細胞均有明顯的抑制作用，抑制率與對照組相比差異均有顯著性，且隨著MTE濃度增加和培養時間的延長，抑制作用增強，且呈明顯的量效關系和時效關系。另外，通過細胞克隆源性分析法驗證MTE對體外培養的HepG2肝癌細胞克隆形成的抑制效果，各實驗組細胞克隆形成率均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。上述兩種實驗表明MTE對HepG2肝癌細胞增殖具有明顯抑制作用。

細胞增殖是細胞生命活動的基本特征之一。細胞通過細胞周期實現增殖，細胞周期調節失控是腫瘤發生、發展的重要原因。細胞周期中某些重要的信號分子和周期蛋白家族發生突變或表達水平發生改變，導致細胞周期調控改變，促使細胞增殖不受控制，分化能力減弱，喪失原有的細胞功能，最終發展成腫瘤細胞[8]。腫瘤細胞增殖的速度主要取決于細胞G0/G1期的長短，G0/G1期短，進入S期細胞增多，則腫瘤細胞增殖快，所以G1/S過渡是細胞周期進程的關鍵[9]。本實驗結果顯示，不同濃度的MTE作用于HepG2肝癌細胞24 h后，肝癌細胞周期發生明顯變化，G0/G1期細胞百分比上升，S期和G2期細胞百分比下降，提示MTE能夠誘導HepG2肝癌細胞G1/S期阻滯，表現為細胞周期停滯在G0/G1期，不能進入S期而使細胞生長周期延長，細胞的惡性增殖減慢。由此提示，MTE對HepG2肝癌細胞具有一定的抑制作用，其機制可能是阻斷細胞周期，從而發揮抗腫瘤作用，但如何影響細胞周期G1/S檢查點調控信號機制仍需進一步研究。