原發性肝癌患者血清miR-146a、miR-202、miR-148b的表達及意義

尹壽新 趙靜 亓麟 周童 楊廷廷 黃加國

原發性肝癌(primary liver cancer，PHC)是一種常見的肝臟惡性腫瘤，侵襲能力極強，是死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。PHC在全球的發病率排名第6位，死亡率排名第3位[2]。>50%的PHC發病原因與乙肝病毒感染相關，每年新增的PHC患者超過50萬例[3]。目前，臨床上對PHC的早期診斷仍很困難，生物學標記物的靈敏性和特異度均不高，導致對肝癌的診斷價值欠佳，因此急需找到對肝癌早期診斷的標志性物質。近年來，微小RNA(miRNA)的異常表達可影響腫瘤的發生和發展過程。miRNAs是一種高度保守的非編碼的單鏈RNA，其在機體內通過在RNA轉錄水平上結合特異性的靶基因，從而達到基因沉默的效果，充當“基因海綿”的作用，從而發揮調節功能[4,5]。相關報道證明，miR-146a在肺癌、乳腺癌和肝癌中表達異常增高，通過高表達來抑制其靶基因的表達，從而影響腫瘤的增殖[6]。另有報道，miR-202在胃癌中表達降低，可抑制胃癌細胞增殖并誘導其凋亡，發揮類似抑癌基因的作用[7]。而miR-148b的相關報道較少，Nie等[8]發現miR-148b的表達與肝癌患者的預后相關。國內外研究發現多種miRNAs在人類肝癌細胞中異常表達[9]。本研究通過對原發性肝癌患者中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達研究，分析其與臨床病理參數的相關性，分析它們之間表達水平的相關性，為肺癌的診斷、治療及預后提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年2月至2019年2月首次治療并經病理確診為原發性肝癌的78例患者作為研究對象。其中男48例，女30例；平均年齡(46.8±6.8)歲；其中具有乙肝病史61例，臨床TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期33例，Ⅲ期18例。另外選取同期體檢正常者58例作為對照組，其中男35例，女23例；平均年齡(44.9±6.4)歲。2組資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，所有研究過程均符合為院醫學倫理委員會的相關規定。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)所有患者經由病理組織學確診；(2)患者的臨床資料均完整性高，且順從性好；(3)經患者及其家屬同意，簽署知情同意書。排除標準：(1)伴有高血壓、長期酗酒等患者；(2)伴有心血管、腎臟病變等患者；(3)伴有其他惡性腫瘤的患者；(4)伴有精神病患者。

1.3 實驗材料與儀器 Trizol試劑由美國Invitrogen公司提供，cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green Master Mix試劑盒均由Vazyme公司提供，酶聯免疫試劑盒由ebioscience公司提供，miR-146a、miR-202和miR-148b引物由南京金唯智生物技術有限公司合成。主要儀器為Thermo公司生產的紫外分光光度計和TCA5020的普通PCR儀，美國ABI公司的7500-實時熒光定量PCR儀，日本SANYO公司提供的凝膠成像分析系統，美國Bio-Rad公司提供的電泳儀和電泳槽，多功能酶標儀由美國Thermo公司提供。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 方法 抽取清晨空腹靜脈血5 ml進行檢測，2 000 r/min離心10 min，分離出血清，應用RT-PCR法檢測miR-146a、miR-202和miR-148b的表達水平。用Trizol試劑提取血清中RNA，整個過程嚴格按照操作說明書進行。提取肝癌患者血清和正常人血清的RNA。miR-146a、miR-202和miR-148b莖環結構逆轉錄引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATGGTT-3’。具體的逆轉錄條件為16℃(30 min)、42℃(30 min)和75℃(15 min)，在進行PCR反應時，先使用95℃變性10 min，溫度維持15 s，而后用60℃反應1 min，連續進行40個循環，每個反應平均進行3次。對反應管中熒光信號達到指定區域經歷的循環數，即Ct值，采用U6為內參，使用相對定量法計算腫瘤組織目的基因表達水平與配對的正常組織相差的倍數，即2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(腫瘤CtmiRNA-CtU6)-(正常CtmiRNA-CtU6)。

1.5 觀察指標 對比肝癌患者和正常人的血清miR-146a、miR-202和miR-148b的表達差異，同時分析其與臨床病理參數的聯系；對miR-210-3p和p21、p53、Ki67和HIF-1α表達水平的相關性進行分析。

2 結果

2.1 2組受試者miR-146a、miR-202和miR-148b表達水平比較 與對照組比較，觀察組肝癌血清中miR-146a的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-202和miR-148b的表達水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 肝癌患者血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達水平與臨床病理參數特征的關系 肝癌血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達水平均與患者的性別、年齡、分化程度、TNM分期、轉移與否、是否發生肝硬化、HBV是否有感染、血清AFP水平、包膜是否浸潤、腫瘤直徑和腫瘤部位均無關(P>0.05)，而與患者的腫瘤數目間差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 2組受試者miR-146a、miR-202和miR-148b表達水平比較

表3 肝癌患者血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達水平與臨床病理參數特征的關系

2.3 2組miR-146a、miR-202和miR-148b的表達水平比較 與非乙肝組比較，乙肝組肝癌血清中miR-146a的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-202和miR-148b的表達水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

2.4 肝癌患者中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達量間的相關性分析 應用Pearson相關性分析發現，肝癌患者中miR-146a的表達水平與miR-202和miR-148b的表達水平呈負相關(r=-0.825，P=0.001；r=-0.768，P=0.012)，而腫瘤患者中miR-202的表達水平與miR-148b的表達水平呈正相關(r=-0.705，P=0.010)。見圖1～3。

表4 乙肝患者和非乙肝患者miR-146a、miR-202和miR-148b的表達水平比較

3 討論

原發性肝癌的發生與發展涉及了很多生物學和化學的致癌因素，其發病隱匿，預后不良，極少數在初期進行手術治療，其腫瘤癌變的機制并不明確。目前，臨床上常用甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)用于早期原發性肝癌的診斷，其檢測靈敏方便；然而，相關研究顯示仍有30%的原發性肝癌患者檢測呈現陰性，陽性表達也有很多[10]，因此，大幅度限制了AFP在肝癌早期檢測的應用。另外臨床上常用活檢和影像學來檢測早期的原發性肝癌，但均由于其靈敏度和特異性的局限性，導致診斷價值欠佳[11]。近年來，隨著分子生物學的發展，miRNAs是近年來研究發現并成為研究熱點的一類小分子編碼RNA。大量研究發現，miRNAa在腫瘤中有表達譜的改變，大部分采集的組織樣本，限制了臨床的應用，但miRNA在血清中穩定存在，不會輕易被RNA酶降解，且水平在組織中具有特異性[12]，因此，miRNA可成為潛在的腫瘤診斷的生物學標記。

目前，大部分miRNA分子都是通過與靶基因的3’UTR區域結合而發揮細胞調節作用。miR-146a，我們通過Targetscan軟件預測其靶基因為FOXO1，FOXO1是一個轉錄因子，是一種抑癌基因，相關研究證明，miR-146a在非小細胞癌、乳腺癌等癌癥中均特異性表達，因其與靶基因FOXO1在mRNA水平特異性結合，從而抑制了抑癌基因FOXO1的表達，從而達到促進腫瘤細胞增殖的作用[13]。FOXO1在調控肝癌發生與發展的機制可能是FOXO1表達下調后，腫瘤細胞周期停滯能力障礙有關。也有相關研究表示，miR-146a可作為癌基因促進宮頸癌和結腸癌的發生與轉移[14,15]。本研究中，原發性肝癌患者中的miR-146a的表達水平是顯著高于正常對照組(P<0.05)，說明了miR-146a在原發性肝癌中是高表達水平狀態。

在靶基因預測軟件Targetscan中，miR-202的靶基因為Gil1。Gil1首次在惡性膠質瘤細胞中被發現，Gil1是腫瘤發生過程中Hh通路上的一個促癌基因，在很多腫瘤中發現高表達，且表達量與腫瘤的分化程度相關[16]，相關文獻證明，在胃癌細胞和組織中，miR-202的表達水平顯著低于正常組，其在體外實驗也證明了miR-202是通過靶向抑制Gil1的表達功能，從而抑制了胃癌細胞的增殖及促進其凋亡[17]。同樣的，miR-148b在報道中已被證實，其靶基因是葡萄糖基轉移酶(GTF2H1)，相關研究證明，GTF2H的rs3802967位點的改變使得GTF2H1的蛋白表達發生變化，導致癌癥患病的風險增加，GTF2H與腫瘤的增殖及轉移具有相關性[18]，關于miR-148b與腫瘤的機制研究甚少。另有研究證實，miR-148b在肝轉移中表達水平顯著下降[19]，在本研究中，發性肝癌患者中的miR-202和miR-148b的表達水平低于正常對照組(P<0.05)。在研究miRNA與臨床病理參數的關系，我們發現miR-146a、miR-202和miR-148b均與腫瘤數目具有相關性(P<0.05)，多發性腫瘤的miR-146a水平高于單發性腫瘤，miR-202和miR-148b的水平低于單發性腫瘤，說明miR-146a、miR-202和miR-148b與肝腫瘤的增殖密切相關。且我們發現，乙肝組miR-146a顯著高于非乙肝患者組(P<0.05)，而miR-202和miR-148b低于非乙肝患者組(P<0.05)，說明乙肝對miR-146a、miR-202和miR-148b的表達均有影響且可作為乙肝的特異性診斷指標。

Pearson相關性分析發現miR-146a與miR-202和miR-148b的表達水平呈負相關(P<0.05)，miR-202與miR-148b的表達水平呈正相關(P<0.05)。其可能的作用機制均為miR-146a、miR-202和miR-148b通過“海綿效應”，在mRNA水平與分別與FOXO1、Gil1和GTF2H靶基因相結合，而靶基因通過多種代謝途徑調節肝癌細胞的增殖與發展，從而達到miRNA影響了腫瘤細胞在患者體內的變化的作用。但其具體機制仍需進一步探索。

綜上所述，miR-146a、miR-202和miR-148b在原發性肝癌的發生與發展中發揮著至關重要的作用，不僅僅對于肝癌或乙肝早期的診斷和治療具有重要的臨床意義，對于肝癌或乙肝患者的預后提供了理論支持。