miR-1260a調(diào)控FEZ1對前列腺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

孫彥申 張躍

前列腺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，調(diào)查顯示我國前列腺癌發(fā)病率逐年上升，前列腺癌發(fā)生發(fā)展與致癌基因、抑癌基因等異常表達密切相關(guān)[1,2]。微小RNA(microRNA，miRNA)可通過與靶mRNA結(jié)合從而參與癌癥、心血管疾病等多種疾病發(fā)生過程[3,4]。因而探究前列腺癌發(fā)生發(fā)展的原因及引起的機制對提高治療效果具有重要意義。研究表明，微小RNA-1260a(microRNA-1260a，miR-1260a)在前列腺患者中高表達[5]。但miR-1260a對前列腺癌細胞生物學(xué)行為的影響尚未見報道。TargetScan預(yù)測顯示亮氨酸拉鏈蛋白(fasciculation and elongation protein zeta-1，F(xiàn)EZ1)可能是miR-1260a的靶基因，研究表明，miR-1260a是一個抑癌基因并可抑制腫瘤增殖[6]。研究報道指出，F(xiàn)EZ1過表達可誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡及抑制增殖[7]。但miR-1260a是否通過調(diào)控FEZ1的表達影響前列腺癌細胞生物學(xué)行為尚未可知。本研究主要探討miR-1260a對前列腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響及機制，分析其對FEZ1的調(diào)控作用，以期為前列腺癌的分子診斷及靶向治療提供新的治療方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年6月至2019年1月于本院診治的前列腺癌患者46例為研究對象，患者均經(jīng)病理證實為前列腺癌，年齡50～70歲，平均年齡(65.25±5.64)歲，所有患者接受手術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療或化療，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。術(shù)中切除前列腺癌組織及其癌旁組織，放入液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 材料與試劑 前列腺癌DU145細胞購自美國ATCC細胞庫。杜氏改良培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-1260a特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-1260a)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-1260a模擬物(mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、FEZ1小干擾RNA(si-FEZ1)、無意義陰性序列(si-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Mgtrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；蛋白裂解液與二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人細胞周期蛋白1(CyclinD1)、B淋巴細胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、P21、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組:前列腺癌DU145細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2，收集對數(shù)生長期DU145細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細胞懸液種于24孔板，待細胞生長融合至70%時進行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染說明書進行操作，實驗分組：anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至DU145細胞)、anti-miR-1260a組(anti-miR-1260a轉(zhuǎn)染至DU145細胞)、anti-miR-1260a+si-NC組(anti-miR-1260a與si-NC共轉(zhuǎn)染至DU145細胞)、anti-miR-1260a+si-FEZ1組(anti-miR-1260a與si-FEZ1共轉(zhuǎn)染至DU145細胞)。為探究miR-1260a靶向調(diào)控FEZ1的表達，實驗分組：miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至DU145細胞)、miR-1260a組(miR-1260a mimics轉(zhuǎn)染至DU145細胞)、anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至DU145細胞)、anti-miR-1260a組(anti-miR-1260a轉(zhuǎn)染至DU145細胞)。4組細胞轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細胞。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中miR-1260a的表達水平:取出凍存前列腺癌組織與癌旁組織及各組細胞，采用Trizol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-1260a正向引物5’-ATCCCACCTCTGCCACCA-3’，反向引物：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(yīng)，參照試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 2 min(循環(huán)1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環(huán)40次)。miR-1260a以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-1260a的相對表達量。

1.3.3 MTT檢測細胞增殖:收集4組對數(shù)生長期DU145細胞，胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3×104個/ml，按照每孔100 μl細胞懸液接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置于振蕩儀低速振蕩10 min，應(yīng)用酶標儀檢測各孔光密度值(OD 490 nm)，以O(shè)D值大小表示細胞活力。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:取4組對數(shù)生長期DU145細胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，室溫條件下1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，棄上清，預(yù)冷PBS清洗，加入500 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)，充分混勻，加入5 μl碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞遷移:取對數(shù)生長期DU145細胞，棄上清，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至5×104個/ml，按照每孔200 μl將細胞懸液接種于Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，放入37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，擦拭未遷移細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察遷移細胞數(shù)。

1.3.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲:預(yù)備實驗：預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠(9∶1)，按照每孔加入40 μl Matrigel稀釋液，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。實驗步驟：取對數(shù)生長期DU145細胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至5×104個/ml，按照每孔200 μl單細胞懸液加入Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，擦去未侵襲細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察侵襲細胞數(shù)。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測:TargetScan預(yù)測顯示miR-1260a與FEZ1存在結(jié)合位點，將結(jié)合位點及突變位點載入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-FEZ1、突變型載體MUT-FEZ1，取對數(shù)生長期DU145細胞，實驗分為4組：WT-FEZ1與miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-FEZ1與miR-1260a mimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-FEZ1與miR-NC共轉(zhuǎn)染組、MUT-FEZ1與miR-1260a mimics共轉(zhuǎn)染組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測4組相對熒光素酶活性。

1.3.8 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、P21、Bax、E-cadherin、FEZ1蛋白表達:收集4組DU145細胞，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，室溫條件下孵育一抗稀釋液，4℃孵育過夜，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫條件下孵育1 h，TBST洗滌，曝光，顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-1260a在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達 與癌旁組織比較，前列腺癌組織中miR-1260a的表達水平顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 miR-1260a在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 抑制miR-1260a對細胞DU145增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1260a組前列腺癌DU145細胞中miR-1260a的表達水平顯著降低(P<0.01)，細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，P21、Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.01)。見圖1，表2、3。

圖1 抑制miR-1260a對細胞DU145增殖、凋亡的影響;A 抑制miR-1260a對細胞DU145凋亡的影響;B 抑制miR-1260a對細胞DU145增殖、凋亡蛋白表達的影響

表2 抑制miR-1260a對細胞DU145增殖的影響

表3 抑制miR-1260a對細胞DU145凋亡的影響

2.3 抑制miR-1260a對細胞遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1260a組遷移與侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.01)，MMP-2蛋白表表達量顯著降低(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量顯著升高(P<0.01)。見表4，圖2。

表4 抑制miR-1260a對細胞遷移、侵襲的影響

圖2 抑制miR-1260a對細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.4 miR-1260a靶向、調(diào)控FEZ1的表達 TargetScan預(yù)測顯示FEZ1的3’UTR含有miR-1260a的互補序列。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染克隆有FEZ1-3’UTR突變型載體質(zhì)粒實驗中，miR-1260a組與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染克隆有FEZ1-3’UTR載體質(zhì)粒實驗中，miR-1260a組熒光素酶活性明顯受到抑制，與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-1260a組DU145細胞中FEZ1蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1260a組DU145細胞中FEZ1蛋白表達量顯著升高(P<0.01)。表明miR-1260a可靶向調(diào)控FEZ1的表達。見表5、6，圖3。

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 miR-1260a調(diào)控FEZ1的表達

圖3 miR-1260a靶向、調(diào)控FEZ1;A FEZ1的3’UTR含有miR-1260a的互補序列；B miR-1260a調(diào)控FEZ1的表達

2.5 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細胞DU145增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與anti-miR-1260a+si-NC組比較，anti-miR-1260a+si-FEZ1組DU145細胞活力顯著升高(P<0.01)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，遷移與侵襲細胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達量顯著升高(P<0.01)，P21、Bax、E-cadherin蛋白表達量顯著降低(P<0.01)。見表7、8，圖4。

表7 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細胞DU145增殖蛋白表達的影響

表8 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細胞DU145凋亡、遷移、侵襲的影響

圖4 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細胞DU145增殖的影響

3 討論

前列腺癌早期診斷方法主要為直腸指檢、前列腺癌特異性抗原等，腫瘤分期等可作為判斷患者預(yù)后的主要指標，但僅依靠臨床病理指標不可準確評估前列腺癌患者預(yù)后[8]。因而積極探尋敏感性與特異性較高的分子標志物可為前列腺癌靶向治療提供實驗依據(jù)。既往研究顯示miR-214、miR-188-5p等miRNA在前列腺癌中異常表達，并可影響前列腺癌細胞增殖、遷移等生物學(xué)行為[9,10]。但仍有部分miRNA在前列腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制尚未完全闡明。

miR-1260a在黑色素瘤等多種腫瘤中均呈高表達，并可能影響腫瘤發(fā)生發(fā)展進程[11,12]。但miR-1260a在前列腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制尚未可知。本研究結(jié)果顯示前列腺癌組織中miR-1260a的表達水平顯著升高，提示miR-1260a的表達水平升高可能促進前列腺癌的發(fā)生。本研究通過體外細胞實驗，以前列腺癌DU145細胞為研究對象，檢測抑制miR-1260a的表達對DU145細胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達可顯著降低DU145細胞活力，說明抑制miR-1260a的表達可抑制前列腺癌細胞增殖。研究表明，P21可負向調(diào)控細胞周期，并可誘導(dǎo)細胞周期停滯于G1期，Cyclin D1在多種腫瘤中表達增加，并可通過增加CDK活性從而促進細胞生長，P21可抑制Cyclin D1與CDK的活性[13]。本研究結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達后DU145細胞中P21的表達水平顯著升高，Cyclin D1的表達水平顯著降低，提示抑制miR-1260a的表達可通過上調(diào)P21的表達及下調(diào)Cyclin D1蛋白的表達而抑制前列腺癌細胞的增殖。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達后前列腺癌細胞凋亡率顯著升高。研究表明，抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax是調(diào)控細胞凋亡的重要基因[14]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-1260a的表達后前列腺癌細胞中Bcl-2的表達水平顯著降低，Bax的表達水平顯著升高，提示抑制miR-1260a的表達可通過上調(diào)Bax的表達及下調(diào)Bcl-2的表達從而誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡。研究表明，E-cadherin表達水平降低可減弱細胞間的黏附從而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，MMP-2表達水平升高可降低細胞外基質(zhì)從而促進腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達后DU145遷移及侵襲細胞數(shù)均顯著減少，并可降低MMP-2的表達，促進E-cadherin的表達，提示抑制miR-1260a的表達可通過上調(diào)E-cadherin的表達及下調(diào)MMP-2的表達從而抑制前列腺癌細胞遷移及侵襲。

FEZ1在食管癌、口腔鱗癌等腫瘤中均呈低表達并可發(fā)揮抑癌基因作用，研究表明，F(xiàn)EZ1的表達降低可促進惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。研究表明，F(xiàn)EZ1在宮頸癌中呈低表達，其低編導(dǎo)量與患者總生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[17,18]。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實FEZ1是miR-1260a的靶基因，miR-1260a可負性調(diào)控靶基因FEZ1的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制FEZ1的表達可逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a的表達對前列腺癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。提示抑制miR-1260a的表達可通過上調(diào)FEZ1的表達，從而達到抑制前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的目的，誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，miR-1260a在前列腺癌中呈高表達，并可能通過抑制FEZ1的表達促進前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，抑制細胞凋亡，為揭示前列腺癌進展及轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機制提供新方向，可為前列腺癌的分子靶向治療提供實驗依據(jù)。但仍需從動物模型與臨床研究分析miR-1260a與FEZ1對前列腺癌嚴重程度、治療效果及患者預(yù)后的預(yù)判價值。