毛蕊異黃酮調控TLR4/p38MAPK通路減輕膿毒癥大鼠心肌損傷的機制研究

劉杰 李萍 高彥霞 吳瑤

膿毒癥是常見的、嚴重的全身炎性反應綜合征，也是臨床上常見的死亡病因。據報道，我國膿毒癥的發病率高，且近年來一直保持著居高不下的態勢[1]。有資料顯示，膿毒癥可發展為多臟器功能衰竭，病死率高達30%～50%，是嚴重困擾醫務工作者的重大疾病之一[2]。目前臨床針對膿毒癥患者常用的治療手段包括控制感染、早期液體復蘇、清除內毒素等，可控制病情，降低病死率，但仍有部分患者病情進展。心肌損傷是膿毒癥常見的繼發癥，可削弱心功能甚至誘發心力衰竭[3]。Toll樣受體4(TLR4)/絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路是炎性反應性疾病經典的信號傳導途徑，在炎癥環境中該通路被激活，TLR4高表達，增加磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)水平，誘發組織損傷，已被證實與膿毒癥心肌損傷有關[4-6]。毛蕊異黃酮是一種常用的化學藥品原料，具有抗氧化、保護心腦血管、舒張血管平滑肌等作用，有研究報道該藥物可減輕心肌損傷[7]。故此推測毛蕊異黃酮可能通過調控TLR4/p38MAPK通路減輕膿毒癥心肌損傷，但仍缺乏有力證據，需深入探討驗證。鑒于此本研究特設計大鼠對照試驗，并將不同濃度毛蕊異黃酮的作用與烏司他丁做對比，明確該藥物對膿毒癥大鼠心肌損傷的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：54只成年SD大鼠，7～9周齡，無特定病原體級，雌27只雄27只，180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京)2018-0001。

1.1.2 試劑：毛蕊異黃酮(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)；烏司他丁(廣東天普生化醫藥股份有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(北京高科恒輝技術發展有限公司)；鼠TLR4、TNF-α、NO酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅染色(HE)試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒(美國Roche公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；TLR4、p38MAPK及內參β-actin上下游引物合成(上海生工科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；兔抗鼠TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK單克隆抗體(一抗)(美國Acadm公司)；山羊抗兔TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗體(以酶標記，二抗)(美國Acadm公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(上海化科實驗器材有限公司)。

1.1.3 儀器：超凈工作臺(美國Labconco公司)；14型臺式離心機(德國Sigma公司)；RM2235型切片機(德國Leica公司)；DSX1000型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；7500型聚合酶鏈反應(PCI)擴增儀及配套分析軟件(美國ABI公司)；Trans-BlotTurbo型轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；GelDocEZ型凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模：54只成年SD大鼠隨機分為6組，包括正常對照組(NC)、模型對照組(MC)、陽性對照組(PC)、毛蕊異黃酮低濃度組(A)、毛蕊異黃酮中濃度組(B)、毛蕊異黃酮高濃度組(C)，每組9只。除正常對照組(NC)外其余均建立膿毒癥模型，建模方法：參照文獻[8]，方法為盲腸結扎穿孔術，具體操作：戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹正中位置做長約1.5 cm切口，尋找盲腸，結扎其根部。以18G針穿通2次，將腸內容物擠出少量。留置2 cm皮瓣，還納盲腸，對腹壁切口逐層縫合，術后常規抗感染、抗休克。NC組操作大致同上，但無需實施環形結扎和穿孔操作。

1.2.2 藥物：PC組予以烏司他丁100 kU/kg溶于1 ml/100 g 0.9%氯化鈉溶液中經腹腔注射；干預 A、B和C組分別予以5、10、20 mg/kg毛蕊異黃酮溶于1 ml/100 g 0.9%氯化鈉溶液中經腹腔注射；MC和NC組均予以1 ml/100 g 0.9%氯化鈉溶液經腹腔注射。1次/d，干預1周。

1.2.3 心肌組織TLR4、TNF-α、NO含量檢測:采用ELISA檢測。麻醉下處死大鼠，迅速剝離心臟組織，取約40 mg心尖周圍組織勻漿，按照3 500 r/min轉速離心10 min，離心半徑為8 cm。取上清并嚴格按照ELISA試劑盒檢測心肌組織TLR4、TNF-α、NO含量。

1.2.4 心肌組織病理改變觀察和細胞凋亡檢測:采用HE法觀察心肌組織病理改變，具體操作：同上述方法取心肌組織，固定、包埋、切片、脫蠟和水化，嚴格按照HE試劑盒染色，封片。在400倍光鏡下觀察心肌纖維和心肌細胞變化。采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數(AI)，具體操作：嚴格按照TUNLE試劑盒操作，陽性染色為凋亡細胞。光鏡下隨機選取10個不重復視野統計陽性細胞占比，計算均值即為AI。

1.2.5 心肌組織TLR4、p38MAPK mRNA表達檢測:采用實時PCR(RT-PCR)檢測，具體操作：同上述方法取心肌組織，液氮冷凍，勻漿后加入Trizol試劑1 ml，反復研磨。按照14 000 r/min轉速離心10 min，離心半徑為3 cm。以酚-氯仿抽提核糖核酸(RNA)，逆轉錄。按照說明書配置反應體系，其中TLR4 上游引物：5’-ACTGCTCTGATATGATCGATAGCTAT-3’；下游引物：5’-TCGATAGCTAGATCGATTAGCTATGATCTAG-3’，長度18 bp、20 bp；p38MAPK 上游引物：5’-TACGCTAGATTTAGCTATAGCTAGGCGAACTC-3’；下游引物：5’-ATCGCTAGATCGATATATCGATCGTAGCT

AGCTA-3’，長度20 bp、20 bp；β-actin為內參，上游引物：5’-CTGCTAGATGCTTATAGCTATTAGCTATAGCTA

GATCGACTAGT-3’；下游引物：5’ATGCCTGAATTCGA

TAGCTATAGCTAGATCGACCG-3’，長度20 bp、20 bp。按照如下流程進行擴增反應，95℃(30 s預變性)，35個循環：95℃(5 s變性)、58℃(20 s延伸)，最后60℃(5 min持續延伸)。采用配套分析軟件確定目的基因的相對表達量，即2-ΔΔCt。

1.2.6 心肌組織TLR4、p38MAPK蛋白表達和p-p38MAPK水平檢測:采用蛋白質免疫印跡法(WB)檢測，具體操作：同上述方法取心肌組織，液氮冷凍，勻漿。按照14 000 r/min轉速離心10 min，離心半徑為3 cm。取上清液分離總蛋白，采用BCA試劑盒定量，轉移至PVDF膜。封閉后加入一抗，孵育過夜(4℃)；加入二抗，孵育2 h(25℃)。顯色并采用凝膠成像分析系統掃描，分析結果，計算蛋白相對表達量和p-p38MAPK水平，其中前者為目的蛋白的灰度值與內參β-actin灰度值的比值，后者為p-p38MAPK的灰度值與p38MAPK灰度值的比值。

2 結果

2.1 干預后心肌組織TLR4、TNF-α、NO含量比較 MC、PC、A、B、C組實驗期間分別有1只、1只、1只、1只、0只建模失敗，建模成功率為91.11%(41/45)，無大鼠意外死亡。干預后MC組心肌組織TLR4、TNF-α、NO含量均高于NC組(P<0.01)，且PC組、A組、B組、C組均低于MC組(P<0.01)，PC組、B組和C組均低于A組(P<0.01)，C組均低于PC組和B組(P<0.01)。見表1。

表1 干預后心肌組織TLR4、TNF-α、NO含量比較

2.2 6組大鼠心肌組織病理變化 NC組大鼠心肌組織細胞均勻分布、纖維條理清晰、呈長梭形；MC組心肌細胞腫脹變形、甚至破裂，大量細胞核固縮深染，心肌纖維嚴重紊亂、變形；A組心肌細胞腫脹變形，部分細胞核固縮深染，心肌纖維有明顯紊亂、變形；PC組和B組部分心肌細胞腫脹變形，少量細胞核固縮深染，心肌纖維有紊亂、輕微變形；C組少量心肌細胞腫脹變形，較少細胞核固縮深染，心肌纖維有紊亂表現，大多呈長梭形且結構致密。見圖1。

2.3 干預后心肌細胞凋亡指數對比 干預后MC組心肌細胞AI高于NC組(P<0.01)，PC組、A組、B組、C組均低于MC組(P<0.01)，PC組、B組和C組均低于A組(P<0.01)，C組均低于PC組和B組(P<0.01)。見圖2，表2。

2.4 干預后心肌組織TLR4、p38MAPK mRNA表達對比 干預后MC組心肌組織TLR4 mRNA表達均高于NC組(P<0.01)，PC組、A組、B組、C組均低于MC組(P<0.01)，PC組、B組和C組均低于A組(P<0.01)，C組均低于PC組和B組(P<0.01)。6組p38MAPK mRNA表達對比差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.5 干預后心肌組織TLR4、p38MAPK蛋白表達及p-p38MAPK水平對比 干預后MC組心肌組織TLR4 蛋白表達、p-p38MAPK水平均高于NC組(P<0.01)，PC組、A組、B組、C組均低于MC組(P<0.01)，PC組、B組和C組均低于A組(P<0.01)，C組均低于PC組和B組(P<0.01)。各組p38MAPK 蛋白表達對比差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖3。

圖1 6組大鼠心肌組織縱切面病理變化(HE×400)

圖2 6組心肌細胞AI檢測(TUNEL×100)

表2 干預后心肌細胞凋亡率比較

表3 干預后心肌組織TLR4、p38MAPK mRNA表達比較

3 討論

膿毒癥早期多以炎性介質增加為基本改變，機體可釋放大量的促炎性因子，包括TNF-α、白介素-6、TLR4等，而抗炎性因子如蛋白激酶C、白介素-4等則分泌較少，難以有效對抗炎性介質的作用，二者平衡被打破，導致過度炎性反應[9]。研究指出，在膿毒癥發生后，促炎性因子的大量釋放可損傷血管內皮細胞，進而造成心臟、腎臟等多個重要臟器功能損害[10]。TNF-α的大量合成和分泌可誘導NO表達上調，并通過NO依賴途徑介導心肌組織損傷[11]。因此在對膿毒癥實施抗心肌損傷治療時應積極抗炎，糾正促炎性因子和抗炎性因子的平衡。

表4 干預后心肌組織TLR4、p38MAPK蛋白表達及p-p38MAPK水平比較

圖3 干預后6組心肌組織TLR4、p38MAPK蛋白表達及p-p38MAPK水平檢測(WB)

心肌組織中促炎因子含量是反映炎性反應程度的直接指標，同時也是評價炎性反應損傷情況的重要標志。本次研究中，干預后MC組心肌組織TLR4、TNF-α、NO含量均遠高于NC組，PC組和3濃度組均較MC組下降，提示烏司他丁和毛蕊異黃酮均可減輕膿毒癥大鼠心肌組織炎性損傷程度，且其作用呈濃度依賴性。在病理學觀察結果中可見MC組心肌組織纖維、細胞均嚴重改變，PC組和3濃度組均有所減輕，且C組與NC組病理學表現最為接近，提示烏司他丁和毛蕊異黃酮均可減輕膿毒癥大鼠的心肌組織病變，且高劑量毛蕊異黃酮的作用更佳。毛蕊異黃酮是黃芪的有效成分之一，黃芪具有益氣復脈、活血化瘀、解毒祛瘀的功效，毛蕊異黃酮也被證實可促使心肌供血恢復，減輕缺血誘導的炎性損傷[12]。有研究發現，毛蕊異黃酮可清除氧自由基、抗氧化應激損傷，還可調節促炎性因子和抗炎性因子的平衡，控制炎性反應對心肌組織造成的損傷[13]。本研究還發現MC組心肌細胞AI顯著高于NC組，PC組和3濃度組心肌細胞AI則較MC組顯著降低，且C組明顯低于其余3組，提示毛蕊異黃酮可控制膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡，且高濃度的作用效果更佳。

TLRs是炎性信號轉導的門戶蛋白，TLR4激活可持續誘導炎性反應，并協同p38MAPK參與膿毒癥心肌損傷的病變過程。本研究TLR4、p38MAPK mRNA與蛋白，p-p38MAPK水平對比結果中顯示，MC組TLR4 mRNA與蛋白，p-p38MAPK水平相較于NC組均顯著升高，PC組和3濃度組相較于MC組顯著下降，且C組明顯低于其余3組，推測毛蕊異黃酮可能對膿毒癥大鼠心肌組織TLR4/p38MAPK信號通路有調控作用。在一項膿毒癥并心肌損傷發生機制的實驗研究中表明，TLR4能對病原相關分子模式特異性識別，刺激信號轉導，并且可介導促炎性介質的合成和釋放，誘發和加重心肌組織炎性損傷[14]。而p38MAPK是其下游重要的炎性反應調控指標，TLR4被激活后可促進p38MAPK的磷酸化反應。p-p38MAPK則可促進白細胞的聚集、活化，調節轉錄因子的活性，促進細胞因子的合成，并且還可調控炎性反應，通過一系列級聯反應，最終可參與膿毒癥介導的心肌損傷。國內外也有相關報道證實TLR4/p38MAPK信號通路的活化在膿毒癥肺損傷、心肌損傷、腎損傷等疾病發生中均積極參與[15-17]，與此同時TNF-α、NO水平增高，從而參與組織炎性反應損傷，表明在膿毒癥治療中抑制TLR4/p38MAPK信號通路相關因子，下調TLR4基因與蛋白表達，控制p-p38MAPK水平對減輕多種臟器結構組織損傷具有重要的意義。有研究顯示，毛蕊異黃酮可通過抗心肌細胞缺氧誘導的氧化應激和炎性反應從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[18]。另有報道指出，對老年膿毒癥大鼠予以參附注射液治療可減輕心肌損害，發揮心肌保護作用，且證實與抑制TLR4的活性、控制炎性因子水平有關[19]。

綜上所述，對膿毒癥大鼠予以毛蕊異黃酮可減輕心肌組織炎性和病理損傷，減少心肌細胞凋亡，且在一定范圍內用藥濃度越高毛蕊異黃酮的作用越佳，推測與抑制TLR4的活性，降低p-p38MAPK水平有關，為臨床用藥的研究提供了新的方向。