香菇多糖對膀胱癌細胞增殖和遷移行為的影響

游文杰，張人杰，周芬芳，郭紫成，王子健，王行環

(1.武漢大學中南醫院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.湖北省人類遺傳資源保藏中心，湖北武漢 430071；3.恩施土家族苗族自治州中心醫院泌尿外科，湖北恩施 445000)

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是具有高發病率和死亡率的泌尿系腫瘤，增殖和遷移在膀胱癌復發和轉移等進程中占據著重要的地位。近20年來，BCa的致病因素仍未充分闡明，治療難度很大，臨床上以術中切除和術后放療等為代表的一線治療方案均難以進一步延長患者生存期[1]。在此背景下，膀胱癌化療，特別是術前新輔助化療逐步得到重視[2]，并在基礎研究和臨床轉化中取得了系列進展[3]。香菇多糖提取自香菇子實體，其主要成分為β-(1，3)-D葡聚糖[4]。由于可增強患者對順鉑和吉西他濱等化療藥物的敏感性，香菇多糖已在肝癌、卵巢癌等腫瘤聯合化療中得到臨床應用[5]。目前，香菇多糖對人膀胱癌的治療效果仍有待進一步研究。本研究采用不同濃度香菇多糖處理膀胱癌UM-UC3細胞，初步探討了香菇多糖抑制膀胱癌細胞增殖和遷移的作用及機制，旨在為臨床轉化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料膀胱癌UM-UC3細胞系購自中國科學院上海典型培養物保藏中心。香菇多糖購自上海Sigma-Aldrich貿易有限公司。DMEM高糖培養基、胎牛血清( fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco生物有限公司。GAPDH、Ki67、CDK2、CDK6、P53、N-cadherin、Vimentin一抗及相應二抗購自上海Abcam貿易有限公司。細胞周期染色試劑盒、ECL化學發光液等購自武漢沃萊邦德貿易有限公司。

1.2 細胞培養及傳代將UM-UC3細胞培養于DMEM高糖完全培養基(含體積分數10%的FBS)中，在37 ℃，體積分數5%的CO2條件下培養至體積分數為80%的匯合度。用體積分數0.25%胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min后按照1∶3的密度傳代。

1.3 噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)實驗以3×103個/孔的密度接種UM-UC3細胞于96孔組織培養板內。24 h后棄去原有培養基，向每孔中加入200 μL含不同濃度香菇多糖的完全培養基。24 h和48 h 后分別向每孔中加入20 μL MTT試劑 (5 mg/mL)并繼續培養4 h。棄去培養基，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，避光混勻后使用多功能酶標儀(SpectraMax，USA)檢測490 nm處的吸光度。

1.4 流式細胞術用低質量濃度(20 μg/mL)和高質量濃度(60 μg/mL)香菇多糖處理UM-UC3細胞48 h。消化并收集細胞沉淀，加入1 mL磷酸鹽緩沖液重懸細胞，3 000 r/min離心5 min。棄去上清，依次加入1 mL DNA染色緩沖液和10 μL碘化丙啶(PI)溶液。室溫下避光孵育30 min后使用流式細胞儀(Beckman，USA)檢測細胞內DNA含量。

1.5 Transwell實驗用無血清DMEM高糖培養基重懸處理后的UM-UC3細胞，并將細胞密度調整至2×105個/mL。采用直徑8 μm的Transwell小室(Corning，USA)進行細胞遷移實驗[6]。上室加入200 μL細胞懸液，下室加入700 μL完全培養基。靜置培養24 h后依次采用40 g/L多聚甲醛固定和1 g/L結晶紫染色。沖洗多余的結晶紫，用棉簽輕拭去上室非遷移細胞，利用倒置熒光顯微鏡(Leica，German)觀察細胞并拍照。

1.6 細胞劃痕實驗將處理后的UM-UC3細胞消化后接種于6孔組織培養板內，待匯合度>90%時利用200 μL移液槍頭在培養板底垂直劃痕。洗凈未貼壁細胞，加入含體積分數為2% FBS的低血清培養基培養24 h后觀察劃痕寬度并拍照。

1.7 Western blot實驗采用裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑提取細胞蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取等量蛋白質進行10 g/L SDS-PAGE電泳，濃縮時電壓設為80 V，分離時電壓設為120 V。電泳后進行轉膜，其參數設為固定電流270 mA，時間100 min。PVDF膜用50 g/L脫脂奶粉封閉后一抗孵育過夜，加入二抗繼續孵育2 h。采用化學發光成像系統(Bio-Rad，USA)檢測蛋白質條帶。

1.8 免疫熒光分析制作細胞爬片，用40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min后再用體積分數為0.3%的Triton X-100室溫下孵育20 min增加細胞膜通透性。隨后進行抗體結合反應，先用體積分數為10%的山羊血清封閉爬片1 h，然后一抗孵育過夜，加入熒光二抗繼續孵育1 h，DAPI溶液染細胞核10 min后封片。利用倒置熒光顯微鏡觀察熒光并拍照。

2 結 果

2.1 香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3細胞增殖采用MTT實驗初步篩選香菇多糖的最適給藥濃度，并進一步通過流式細胞術驗證香菇多糖對膀胱癌細胞增殖的抑制效果。如圖1A所示，將空白組(0 μg/mL)相對細胞活力設定為100%，則10、20、40、60、80、100 μg/mL組的24 h相對細胞活力分別為(93.7±5.1)%、(76.1±4.9)%、(59.2±3.9)%、(50.4±3.0)%、(31.8±2.4)%，48 h相對細胞活力分別為(89.9±4.9)%、(79.4±4.1)%、(66.4±4.1)%、(49.9±4.9)%、(43.4±2.6)%、(25.8±1.3)%。在此基礎上，我們選取0 μg/mL作為空白組、20 μg/mL作為低質量濃度組、60 μg/mL作為高質量濃度組進行后續實驗。如圖1B、C所示，與空白組(53.2±2.1)%相比，低質量濃度組和高質量濃度組中G0/G1期細胞比例分別上升至(57.2±0.9)%和(67.9±0.5)%，差異具有統計學意義(P<0.05)。此外，Ki67免疫熒光強度隨香菇多糖濃度上升而呈現降低趨勢。綜上所述，香菇多糖可顯著抑制膀胱癌UM-UC3細胞增殖，其機制可能與G0/G1期細胞周期阻滯有關。

2.2 香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3細胞遷移Transwell實驗的結果如圖2A、C所示，空白組、低質量濃度組和高質量濃度組遷移細胞數分別為(308±30)、(222±27)、(86±12)個。劃痕遷移實驗結果如圖2B、D所示，空白組、低質量濃度組、高質量濃度組24 h劃痕愈合率分別為(56.2±2.4)%、(44.2±4.2)%、(19.4±2.9)%。與空白組比較，低濃度組和高濃度組細胞遷移能力受到顯著的抑制(P<0.05)，并呈現出明顯的劑量依賴性。

A：不同質量濃度(0、10、20、40、60、80、100 μg/mL)香菇多糖處理24 h和48 h后膀胱癌UM-UC3細胞的增殖活力；B：不同質量濃度香菇多糖(0、20、60 μg/mL)處理UM-UC3細胞48 h后，細胞周期G0/G1期細胞比例顯著上升；C：細胞周期的流式結果圖，同時免疫熒光提示UM-UC3細胞內Ki67蛋白表達隨香菇多糖質量濃度上升呈現下降趨勢。*P<0.05，***P<0.001。

A、C：不同質量濃度(0、20、60 μg/mL)香菇多糖對UM-UC3細胞Transwell遷移能力的抑制效果；B、D：香菇多糖抑制UM-UC3細胞的劃痕遷移能力。隨香菇多糖質量濃度上升，UM-UC3細胞的遷移細胞數和劃痕愈合率均顯著降低。與對照組相比，差異均具有統計學意義。**P<0.01，***P<0.001。

2.3 香菇多糖參與調控細胞周期和上皮間充質轉化通路Western實驗結果如圖3所示。經不同質量濃度香菇多糖處理后，膀胱癌UM-UC3細胞中周期上皮間充質轉化基因(N-cadherin、Vimentin)和周期相關基因(CDK2、CDK6)蛋白表達明顯下調，原癌基因P53蛋白表達增加。該結果表明：香菇多糖可能通過阻滯細胞周期和抑制上皮間充質轉化途徑從而抑制膀胱癌細胞增殖和遷移。

圖3 免疫印跡分析蛋白標志物表達情況

3 討 論

新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NAC)是肌浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)患者在接受根治性手術前進行的化療。NAC在提高MIBC患者耐受性、減滅微小轉移灶、預防復發和轉移、改善預后和5年生存期等方面具有顯著的效果，且已被歐洲泌尿外科指南列為T2-T4cN0M0期患者的優選治療方式(A類推薦)[7]。臨床常用的膀胱癌化療藥物包括順鉑、吉西他濱、長春新堿和甲氨蝶呤等，但尚無一種化療藥物及其組合物能完全滿足臨床需求[8]。因此，篩選新型化療藥物，豐富備選化療藥物在擴展新輔助化療適應證、提升化療效果、減少耐藥性產生等方面具有一定的戰略意義。

湖北省人類遺傳資源保藏中心是華中地區在建規模最大的生物樣本庫，目前已獲批國際生物與環境樣本庫協會保藏資質。中心可為高通量藥物篩選及分子診療等轉化醫學研究提供高質量的腫瘤樣本和信息服務。前期工作中，我們基于臨床需求篩選得到香菇多糖、辣椒素、二氫楊梅素等具有優異抗腫瘤活性的植物源性藥物，并進一步驗證了其作用效果和機制。馬莉等[9]報道香菇多糖可通過PI3K/AKT信號途徑誘導白血病細胞凋亡。李靜等[10]將香菇多糖首次應用于肺癌聯合化療，有效的提高了患者的免疫力，減輕了不良反應。值得一提的是，目前香菇多糖在膀胱癌中的基礎研究報道較少，臨床試驗仍未見報道。

本研究中，我們采用MTT、流式細胞術和免疫熒光等實驗揭示了香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3細胞增殖和遷移的效果。經香菇多糖處理后，UM-UC3細胞周期成功阻滯于G0/G1期，Ki67蛋白熒光強度明顯下調，遷移細胞數和劃痕愈合率均得到顯著降低(P<0.05)。進一步采用不同濃度香菇多糖處理膀胱癌細胞可有效抑制上皮間充質轉化基因(N-cadherin、Vimentin)和周期相關基因(CDK2、CDK6)的蛋白表達，上調原癌基因P53的蛋白表達。上皮間充質轉化是膀胱癌細胞獲取高遷移和侵襲能力的基礎，其生物學功能得到廣泛報道[11-12]。本研究結果表明：香菇多糖可能是通過阻滯細胞周期和抑制上皮間充質轉化途徑，從而達到抑制膀胱癌細胞增殖和遷移的效果。

綜上所述，香菇多糖具有優異的體外抗腫瘤活性。香菇多糖的體內抗腫瘤活性以及生物安全性等有待后續進一步的研究。香菇多糖來源廣泛，抗腫瘤效果好，毒副作用小，有望順利申請一項Ⅰ類新藥，并推廣應用于膀胱癌新輔助化療[13-14]。