基質輔助激光解吸附電離質譜成像技術在帕金森病研究中的應用

王磊，朱婷，董曦，于淼，孫桂波*（1.哈爾濱商業大學，哈爾濱 150006；.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，中藥（天然產物）創新藥物研發北京市重點實驗室，中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室，天然藥物、健康產品的研究與開發實驗室，中國醫學科學院基于經典名方的新藥發現重點實驗室，北京 100193）

帕金森?。≒D）是一種進行性中樞神經系統退行性疾病，是一種常見的運動障礙性疾病，多發于老年人群，其患病率在神經系統退行性疾病中僅次于阿爾茨海默?。ˋD）[1]。PD 臨床癥狀主要表現為震顫、肌肉僵直、運動遲緩、步態失調、自主神經功能紊亂、嗅覺功能減退、感覺障礙等。多數PD 是先天的，并可通過基因遺傳[2]。PD 的主要病理變化是中腦黑質紋狀體多巴胺能神經元的缺失和路易小體的沉積[3-5]。目前，臨床上對腦組織生物切片進行研究的手段主要為免疫組織化學技術，該方法敏感性高、特異性好，但該方法耗時較長，難以對多種分子同時顯色成像[6]。

質譜（MS）已廣泛用于生物分子的分析，質譜成像技術（MSI）已成為直接檢測組織樣品中生物分子的強大工具，包括蛋白質[7]、肽[8]、代謝產物[9-11]、磷脂[12-13]和藥物[14]等。相較于傳統的MS 技術，MSI 無需對樣品進行復雜的前處理，且能保留物質的原位信息，這些特點使得MSI 分析方法在生物標志物的識別、代謝機制的研究、刑事科學及食品科學等領域均有廣泛的應用前景[15-18]。目前，在MSI 的研究中，最重要的電離源是基質輔助激光解吸/電離（MALDI）、二次離子質譜（SIMS）和解吸電噴霧電離（DESI）[19-20]。與 MALDI成像相比，SIMS 與DESI 成像的主要優勢是不需要外加基質輔助電離，工作流程更便捷，因而在實時臨床病理診斷上更有優勢。然而，SIMS 與DESI 成像很難對大分子量的化合物（如多肽、蛋白及核酸等）進行分析，且DESI 成像的空間分辨率精度較低[6，20]。而MALDI-MSI 技術由于其具有無需任何標記、能夠快速高效地對組織表面生物分子進行高通量成像分析的優勢，成為對生物分子進行空間分析的強大工具[21]。本文將簡要評述MALDI-MSI的工作原理及其進展，著重介紹近年來MALDIMSI 在帕金森病中的應用。

1 MALDI-MSI 簡介

1.1 工作原理

MALDI-MSI 的基本工作原理是將不同分析物樣本分散在基質分子中形成樣品與基質的共結晶，利用激光作為能量來源輻射結晶體，基質分子經輻射所吸收的能量使樣本吸附，基質與樣本間發生電荷轉移從而使樣品分子電離，樣本離子經高壓加速、聚焦后進入飛行時間質譜分析器進行質量分析，示意圖見圖1。檢測器將檢測到的不同質荷比（m/z）的離子以質荷比為橫坐標，離子峰為縱坐標與圖譜庫進行對比，得到鑒定結果并最終確定離子在樣本組織內的分布[22-23]。

圖1 MALDI-MSI 工作原理示意圖Fig 1 Schematic diagram of MALDI-MSI working principle

在成像的過程中，首先需要將吸收紫外光的有機小分子基質均勻地沉積在待分析的組織切片上，然后將已沉積基質的切片送入裝有MALDI離子源的質譜儀，使用紫外波長的激光對切片進行轟擊。切片表面的有機基質吸收紫外光后，將能量和電荷傳遞給生物分子，輔助它們解吸電離，利用聚焦電離源（帶電霧滴、激光、離子源）在樣品切片組織上逐點轟擊即可得到分子在該切片上的空間分布圖[6]。

1.2 工作流程

對福爾馬林石蠟包埋或新鮮冷凍組織樣品進行MALDI-MSI 分析：先將組織切成10 μm 薄片并均勻平整地貼在適當的導電載玻片上（新鮮冷凍組織可以直接用于基質噴涂，而福爾馬林石蠟包埋組織需要去石蠟和抗原修復）；接下來，在玻片上噴灑MALDI 基質，基質的選擇對實驗成功至關重要，MALDI-MSI 實驗中最常使用的基質有2，5-二羥基苯甲酸、3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（芥子酸）和α-氰基-4-羥基肉桂酸；基質噴灑后，通過激光束照射載玻片到選定的組織區域來收集成像質譜，從獲取的質譜圖生成的離子圖像與組織學染色的組織進行比較，以研究目標分析物在特定組織學特征內的分布[24]，示意圖見圖2。

圖2 MALDI-MSI 工作流程示意圖Fig 2 Schematic diagram of MALDI-MSI workflow

2 MALDI-MSI 在中樞神經系統疾病研究中的優勢

中樞神經系統疾病（central nervous system，CNS）以特異性神經元的大量丟失為主要特征，是一類進行性發展的可致殘，嚴重可致死的復雜疾病，其主要包括AD、PD、亨廷頓?。℉D）、肌萎縮性側索硬化癥（ALS）、腦血管疾病（包括中風、偏頭痛和其他頭痛疾?。┘耙蝾^部外傷引起的神經系統外傷[25-26]。而CNS 發病機制十分復雜，因此在分子水平上闡明神經系統疾病致病過程，以及各個腦區的能量代謝、神經遞質和細胞表型的變化是十分必要的。在之前的動物實驗研究中[27]，為了檢測這些小分子的變化，如ATP、葡萄糖、谷氨酸等，需要獲取所需要的腦組織制備成組織勻漿或者通過微量透析的方法取腦細胞間隙液進行LC-MS、ELISA 實驗。雖然核磁共振（NMR）也可以分析腦區的小分子分布和含量，但是由于NMR 能夠檢測的小分子種類有限，分辨率低，使分子結構接近的物質信號難以區分。因此建立一種能夠在組織上原位檢測這些小分子的技術對于中樞神經系統疾病研究十分必要。

與傳統的生物組織成像技術相比，MALDIMSI 最重要的特點就是高通量，即能夠同時檢測大量物質，且具有無標記檢測的能力。其次，其無需對完整的組織進行研磨便可以直接進行質譜檢測，反映物質分布的空間信息。此外，MALDI-MSI 通過與解剖圖譜進行對比，將不同腦區精確定位[9，27-28]，從而將復雜腦組織簡單化，不僅能為組織結構學、代謝學研究提供新思路，并且樣品處理簡便，可用于大量生物樣品的快速檢測[19，24]。

3 MALDI-MSI 在PD 研究中的應用

近年來，MALDI-MSI 被廣泛用于PD 腦組織成像，研究內容包括MALDI-MSI 在PD 動物模型中的應用、靶向MALDI-MSI 用于PD 動物模型的驗證、動物模型中PD 相關蛋白的靶向性MALDI-MSI研究、MALDI-MSI 探索PD動物不同腦區的差異蛋白質組效應、MALDI-MSI 定位PD 患者神經遞質的變化和MALDI-MSI 檢測新型PD 藥物在嚙齒類動物腦內的空間分布。

3.1 MALDI-MSI 在PD 動物模型中的應用

迄今為止，利用MALDI-MSI 進行蛋白質組學研究已經應用于一些PD 動物模型。其中，MALDI-MSI 研究的一個模型是通過立體定向手術將6-羥基多巴胺（6-OHDA）單側注射到黑質致密部（SNPC），通過多巴胺和去甲腎上腺素轉運體攝取后使多巴胺能神經元退化[29]。6-OHDA的毒性來源于其被單胺氧化酶B（MAO-B）氧化，此外，6-OHDA 經過自動氧化，產生過氧化氫、活性氧化物和兒茶酚胺醌。因電子傳遞鏈復合物I 的功能受損，線粒體功能也受到6-OHDA的影響[30]。

MALDI-MSI 研究的另一種帕金森病模型是通過向嚙齒動物大腦的一側注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP），該模型再現了靈長類帕金森病的所有臨床表現，但沒有形成路易氏包涵體[31]。與6-OHDA 不同，MPTP很容易通過血腦屏障，隨后在星形膠質細胞中被MAO-B 氧化成N-甲基4-苯基吡啶（MPP＋）。MPP＋是一種實際的神經毒性化合物，由突觸前再攝取系統在細胞內積累，并通過線粒體復合物I 抑制電子傳遞，最終導致細胞死亡[32-33]。

3.2 靶向MALDI-MSI 用于PD 動物模型的驗證

Kadar 等[34]研究MPTP 模型的臨床有效性，應用MALDI-MSI 研究經鼻給藥后小鼠腦組織中神經毒性成分MPP＋的分布。空間分辨率為70 μm 的MPP＋對應的m/z的離子圖像顯示，MPTP給藥10 min 后，化合物幾乎可以在整個大腦中檢測到；而90 min 后，MPP＋主要集中在多巴胺能區，包括SNPC。以上發現有力地支持了鼻腔給藥是研究PD 有效模型的重要途徑。

3.3 MALDI-MSI 研究動物模型中PD 相關蛋白的靶向性

FKBP-12 是實驗性帕金森病藥物他克莫司（FK506）的結合位點，在實驗性帕金森病模型中具有神經保護和神經再生的特性[35-37]。Nilsson等[38]的研究旨在探討免疫親和素蛋白FKBP-12是否在6-OHDA 單半球受損大鼠腦的紋狀體中顯示出解剖學表達差異。應用MALDI-MSI 技術，作者發現FKBP-12（m/z11791）離子強度在損毀大鼠紋狀體背側和內側升高，但在腹側無明顯變化[38]。該發現為PD 藥物研究提供了新視角。

神經肽是大腦中重要的信號分子，其表達水平的變化與PD 等神經疾病有關[39-40]。Hulme 等[40]采用單側6-OHDA PD 大鼠模型，通過MALDIMSI 檢測腦啡肽、強啡肽、速激肽和神經降壓素與多巴胺能去神經和左旋多巴治療相關的變化，研究在多個腦區成像腦啡肽、強啡肽、速激肽、神經降壓素與多巴胺能去神經和左旋多巴治療相關的變化。利用高橫向分辨率成像觀察到多巴胺耗竭后蒼白球背側亞區神經降壓素增加。這項研究表明質譜成像在闡明PD 及其治療過程中神經肽信號的動態變化的能力。

3.4 MALDI-MSI 探索PD 動物不同腦區的差異蛋白質組效應

一項MALDI 圖譜研究，調查了左旋多巴（L-DOPA）對6-OHDA 處理的大鼠12 個感興趣腦區的影響。在L-DOPA 治療組中，有7 個m/z峰在兩個半球的相應位置表達有差異，而在生理鹽水對照組中表達沒有差異。這些差異表達的多肽中有5 個位于6-OHDA 損傷的紋狀體，3 個紋狀體峰可被鑒定為鈣調蛋白和細胞色素c 氧化酶亞基V Ⅱa-L 和細胞色素c 氧化酶。且翻譯后修飾（PTM）的新位點在大腦多巴胺缺乏一側的紋狀體中表達增加，而這種變化在L-DOPA 治療后減弱，表明L-DOPA 對6-OHDA 損傷大鼠的治療作用主要定位于紋狀體區[41]。

蛋白水解酶的腦區特異性表達可以控制內源性神經肽的生物活性，最近已成為治療神經病理性疼痛、癌癥和PD 的新藥開發的靶點。Bivehed等[42]分析了強啡肽B 作為模型神經肽的轉化和降解產物，以及肽酶抑制劑在不同腦區腦組織切片上的應用效果。結合原位酶組織化學和MALDI-MSI 法發現，在皮層產生強啡肽B（1-7），在紋狀體產生強啡肽B（2-13）[42]。

3.5 MALDI-MSI 定位PD 患者神經遞質的變化

Shariatgorji 等[43]采用2，4-二苯基吡喃四氟硼酸鹽（DPP-TFB）衍生化伯胺為基質，采用MALDI-MSI 法檢測了假手術、6-OHDA 和D3-LDOPA（6-OHDA）損傷后大鼠腦內多巴胺、γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（GLU）和ACh 等低分子化合物。在6-OHDA 損傷的動物模型中，作者發現紋狀體多巴胺水平降低，GABA 水平升高。而 PD 的發病機制研究主要基于神經信號傳遞的改變，因此推測這些神經遞質在腦組織中的改變可能與PD 的發病機制有關。

SNPC的多巴胺能神經元可以高度支配殼核和尾狀核，帕金森患者大腦殼核和尾狀核中存在多巴胺能纖維的喪失（帕金森病的典型特征）。此外，盡管患有帕金森的患者死亡時間很長后仍然能夠檢測到其他生物學上重要的神經遞質（NT）。Shariatgorji 等[44]將2-氟-1-甲基吡啶鎓（FMP-10）用于帕金森紋狀體人腦組織切片的成像，選擇尾狀核，內膜莢膜和殼核用于MALDI-MSI 分析，并使用20 μm 的橫向分辨率進行研究，發現在尾狀核和殼核結構中都檢測到NTs 和相關代謝產物，如多巴胺和3-甲氧基酪胺（3-MT)，而莢膜內部這些代謝物水平相對較低，表明衍生的DA 及其代謝物3-MT 大部分位于腹側尾狀核。

3.6 MALDI-MSI 檢測新型PD 藥物在嚙齒類動物腦內的空間分布

MALDI-MSI 已被用于治療PD 進展的新藥研究中。喹惡啉衍生物，如2-甲基-3-苯基-6-氨基-喹惡啉（MPAQ），對多巴胺能中樞神經系統神經元具有保護作用。在MPAQ 處理的小鼠上進行MALDI-MSI 實驗，將HCCA 基質涂在14 μm厚的腦切片上，采集位點之間的距離為70 μm，結果發現MPAQ（m/z237.1）主要定位于紋狀體和腹側中腦[45]。該研究結果支持MAPQ 可以作為PD 神經保護治療的候選藥物。

4 結語

在過去十年中，針對神經退行性疾病和精神疾病的生物醫學研究逐漸將MALDI-MSI 納入對人和動物中樞神經系統組織中的蛋白質、脂質、神經肽和小分子療法進行有針對性檢測的研究中[6]。MALDI-MSI 技術在AD、PD、精神分裂癥和ALS 研究領域已展開研究，而其他神經退行性和精神疾?。ㄈ缫钟舭Y）則暫無相關應用。雖然樣本量很小，而且許多研究的焦點都集中在證明該技術在神經和精神病學研究問題的適用性上，但這部分文獻清楚地展示了MALDI-MSI 在未來研究項目中的潛力。在未來，MSI 應著重于定量方法學的發展。盡管不同研究組開展了質譜成像對藥物或內源分子絕對濃度的測量方法，但利用質譜成像定量分析依然沒有統一、穩定的方案。另外，目前MSI 在探索各種分子在中樞神經系統作用機制方面仍缺乏深入研究。通過結合多組學分析及分子生物學技術，MSI 將有望為CNS機制研究提供更大助力。