醋酸潑尼松片在中國人體內的藥動學研究

李庚喜，劉麗芳，李良，劉海艷，周亞麗，楊柳，鄧倩，丁勁松（1.中南大學湘雅藥學院，長沙 410000；2.邵陽學院，湖南 邵陽 422000；.長沙晶易醫藥科技有限公司，長沙 410205）

潑尼松是1954年合成的一種糖皮質激素藥物[1]。它本身沒有生理活性，在體內酶的催化作用生成潑尼松龍而產生藥理效應[2-4]。潑尼松和潑尼松龍是一對可逆代謝藥物[5]，見圖1。它們廣泛應用于臨床，主要用于各種急性嚴重細菌感染、嚴重過敏性疾病、膠原性疾病、風濕病、類風濕關節炎等疾病的治療[6-9]。

圖1 醋酸潑尼松、潑尼松、潑尼松龍體內轉化圖Fig 1 In vivo transformation of prednisone acetate，prednisone and prednisolone

醋酸潑尼松，為白色或類白色結晶性粉末，是潑尼松的醋酸酯類藥物，屬國內特有品種。微溶于乙醇或氯仿，幾乎不溶于水[10]。研究證實，潑尼松成醋酸酯后，電子云密度增加，從而增加了潑尼松穩定性。醋酸酯潑尼松更容易被胃腸道吸收，在體內能夠快速水解[11-12]。經文獻調研，醋酸潑尼松在中國人體內轉化過程，吸收速度及吸收程度尚不清楚；與相同劑量（同摩爾）的潑尼松龍片在人體內吸收總量（暴露量）尚不明確；中國境內的醋酸潑尼松片說明書的藥動學尚不完整，不能滿足臨床使用過程的劑量調整和劑量變化的需要。因此，闡明醋酸潑尼松片在體內的吸收代謝變化規律，并將其與潑尼松龍進行比較是一件具有重要意義的事情。本文研究了醋酸潑尼松片在中國健康人群的藥動學特點，并比較醋酸潑尼松片和潑尼松龍片兩者在體內的暴露量情況。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD XR、島津8050（日本島津公司）；SQP/SECURA225D 分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；XW-80A 微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠）；海爾超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）；臺式高速冷凍離心機TGL 18（長沙英泰儀器有限公司）；超純水儀GZY-Y40（湖南科爾頓水務有限公司）；超聲波清洗器KQ-250（昆山美美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

醋酸潑尼松片（山東新華制藥股份有限公司，批號：2005402，規格：5 mg/片）；潑尼松龍片（Pfizer AB，批號：X32041，規格：5 mg/片）；潑尼松龍對照品（PNSL）（批號：100153-201405，含量：99.5%）、潑尼松對照品（PNS）（批號：100199-201503，含量：99.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；內標潑尼松龍-d8（PNSL-d8）（Toronto Research Chemicals，批號：15-UPA-67-5，純度：97.71%）；甲醇（HPLC 級，Merck）；甲酸（HPLC級，ACS）。

2 方法與結果

2.1 血漿中潑尼松與潑尼松龍測定方法的建立

2.1.1 LC-MS/MS 測定條件 色譜條件：分析柱為 ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×75 mm，1.8μm）；流動相A 相為含 0.1% 甲酸水溶液，B 相為甲醇；采用梯度洗脫（0 ～2.60 min，59%B；2.60 ～2.70 min，59% ～95%B；2.70 ～3.50 min，95%B；3.50 ～3.60 min，95% ～59%B；3.6 ～5.0 min，59%B）。流速：0.300 mL·min－1；柱溫為40℃；進樣量為10 μL。

質譜條件：離子源為電噴霧電離源（ESI源），正離子方式檢測，分析模式質譜多反應監測（MRM），接口溫度250℃、DL 管溫度250℃、加熱塊溫度350℃、霧化氣流量3.00 mL·min－1、加熱氣流量10 mL·min－1、干燥氣流量10 mL·min－1。待測物和內標MRM 檢測的定量離子反應為：m/z361.20 →147.00（PNSL）、m/z359.10 →147.00（PNS）、m/z369.05 → 151.10（內標PNSL-d8），如圖2。

圖2 子離子掃描圖Fig 2 Mass spectrometry

2.1.2 溶液配制

① 精密稱量PNSL 對照品約10.00 mg，經校正因子折算后，加入適量甲醇震蕩混勻，配制成含PNSL 10.00 mg·mL－1的儲備液。－20℃儲存備用。

② 精密稱量PNS 對照品約10.00 mg，經校正因子折算后，加入適量甲醇震蕩混勻，配制成含PNS 5.000 mg·mL－1的儲備液。－20℃儲存備用。

③ 將PNSL 和PNS 儲備液按比例混合，并用50%甲醇水（V/V）逐級稀釋至標準系列溶液所需濃度的標準曲線溶液和質控工作液。－20 ℃儲存備用。

④ 以PNSL-d8 作為內標，用甲醇（含0.01%甲酸）稀釋至5.000 ng·mL－1，儲存在2 ～8 ℃，備用。

2.1.3 血漿樣品處理方法 用人混合血漿新鮮配制系列標準曲線溶液；用移液器分別精密移取血漿樣本100 μL 至相應的96 孔板中；各孔中加入300 μL 內標溶液（5.000 ng·mL－1），渦旋5 min，2480×g、4℃離心10 min；轉移150 μL 上清液至96 孔板中加50.0 μL 蒸餾水稀釋；充分混勻，用錫箔紙封膜后放入自動進樣器或2 ～8℃冰箱準備進樣。

2.1.4 稀釋驗證樣品處理 取10.0 μL 質控工作液，加入190 μL 空白血漿，配制成含PNSL/PNS（500.0/200.0 ng·mL－1）人血漿樣品后，再用空白基質稀釋10 倍，精密移取稀釋后的血漿樣品100 μL，按照“2.1.3”項下方法制得。

2.2 方法學驗證[12-14]

2.2.1 專屬性考察 取“2.1.2”項下溶液，在“2.1.1”項條件下進樣測定，記錄色譜圖（見圖3）。PNSL、PNS 和內標PNSL-d8 的保留時間分別為2.05、1.65、2.00 min，空白血漿中的內源性物質不干擾藥物和內標的測定，由圖分析可知，基質成分不干擾目標物的測定，本試驗方法選擇性強。

圖3 典型色譜圖Fig 3 Typical chromatogram

2.2.2 標準曲線和定量限

① PNSL 標準曲線的回歸方程y＝0.096x＋0.018（r2＝0.9992），線性范圍為1.000 ～200.0 ng·mL－1，定量限為1.000 ng·mL－1，連續測定6 個定量限樣本，準確度為106.90%，RSD為8.5%。

② PNS 標準曲線的回歸方程y＝0.070x－0.057（r2＝0.9991），線性范圍為0.4000 ～80.00 ng·mL－1，定量限為0.4000 ng·mL－1，連續測定6 個定量限質量濃度樣本，計算準確度為102.4%，RSD為11%。

2.2.3 精密度和方法回收率 按照表1配制不同質量濃度的樣品溶液，各平行6 份，按“2.1”項下方法測定，結果方法精密度與方法回收率良好，符合生物樣品分析要求，見表1。

表1 潑尼松、潑尼松龍在人血漿中批間和批內精密度、準確度Tab 1 Precision and accuracy of prednisone and prednisolone in human plasma in inter and intra assay

2.2.4 穩定性 儲備液（甲醇）在室溫條件4.5 h 內穩定；工作液（50%甲醇水，V/V）在室溫6 h 穩定；基質樣品前處理6 h 穩定、凍融循環5 次穩定、自動進樣器條件（約5℃）存放113 h 穩定、－80℃存放100 d 穩定，見表2。

2.2.5 基質效應 通過試驗發現，內標歸一化的基質效應符合要求。6 個不同來源的基質經內標歸一化后的基質效應結果顯示PNSL 的LQC（質控低濃度，3.000 ng·mL－1）、MQC（質控中濃度，15.00 ng·mL－1）和HQC（質控高濃度，150.0 ng·mL－1）樣品的變異系數分別為1.42%、3.31%和1.15%。PNS 的LQC（1.200 ng·mL－1）、MQC（6.000 ng·mL－1）和HQC（60.00 ng·mL－1）樣品的變異系數（CV）分別為4.20%、4.23%和3.23%。均小于15%，符合9012 法規生物樣本檢測的規定。

2.3 醋酸潑尼松片與潑尼松龍片藥動學比較研究

該項試驗方案經中南大學倫理委員會批準[批件號為2018 倫審第（21）號]，研究嚴格遵守世界醫學會制定《赫爾辛基宣言》的有關倫理準則。本試驗入組健康受試者16例，其中男性15例，女性1例，年齡在19 ～39 歲，體質量在45.0 ～83.7 kg，BMI 在（22.08±2.45）kg·m－2。所有受試者均充分了解試驗方案和過程，并簽署知情同意書。

2.3.1 給藥與血樣采集 受試者于試驗前1日晚上入住病房，禁食10 h 以上。試驗當日早上8：00 ～8：16 在研究人員的監督下，在坐姿下空腹單次口服對照制劑（R）潑尼松龍片1 片（5 mg）或受試制劑（T）醋酸潑尼松片1 片（5 mg），用240 mL 水送服，服藥前后1 h 內禁止飲水（服藥時的240 mL 水除外），服藥4 h 內禁食。雙周期試驗，每周期內各8 人。分別于給藥前（0 h）及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24 h 采集靜脈血各4 mL 置于預冷的肝素鈉抗凝采血管中。全血樣品采集后60 min 內離心（4℃、2000 g 離心10 min）備存。

表2 基質樣品穩定性(n ＝6)Tab 2 Stability of matrix samples (n ＝6)

2.3.2 醋酸潑尼松片體內藥動學參數 16 名健康受試者單次口服5 mg 醋酸潑尼松片與潑尼松龍片后，按照“2.3.1”項下方法采集血樣，按“2.1”項下方法測定，主要藥動學參數見表3和表4。

表3 空腹服用醋酸潑尼松片與潑尼松龍片的血漿中潑尼松平均藥動學參數比較(n ＝16)Tab 3 Mean pharmacokinetic parameters of prednisone in plasma after administration of prednisone acetate tablets and prednisolone tablets on empty stomach (n ＝16)

表4 空腹服用醋酸潑尼松片與潑尼松龍片的血漿中潑尼松龍平均藥動學參數比較 (n ＝16)Tab 4 Mean pharmacokinetic parameters of prednisolone in plasma after administration of prednisone acetate tablets and prednisolone tablets on empty stomach (n ＝16)

2.3.3 醋酸潑尼松片與潑尼松片體內藥動學曲線

16 名健康受試者單次口服5 mg 醋酸潑尼松片或潑尼松龍片，平均血藥濃度-時間曲線如圖4。

圖4 潑尼松龍和潑尼松平均血藥濃度Fig 4 Mean blood concentration curve of prednisolone and prednisone

2.3.4 醋酸潑尼松片和潑尼松龍片體內藥動學參數統計分析 醋酸潑尼松在體內經過代謝生成有藥理作用的活性物質潑尼松龍，其中醋酸潑尼松的分子量為400.47，潑尼松龍的分子量為360.45。雖然醋酸潑尼松片和潑尼松龍片給藥劑量均是5 mg，但其物質的量并不相同，即使醋酸潑尼松100%轉化，也只相當于給藥潑尼松龍4.5 mg。采用Winnonlin 8.1 統計學軟件進行結果統計，并對結果進行分子量折算，結果見表5和表6。

表5 醋酸潑尼松片折算后血漿中潑尼松龍藥動學參數的統計分析(n ＝16)Tab 5 Statistical analysis of prednisolone pharmacokinetics parameters in plasma after conversion of prednisone acetate tablets (n ＝16)

表6 醋酸潑尼松片折算后血漿中潑尼松藥動學參數的統計分析(n ＝16)Tab 6 Statistical analysis of prednisone pharmacokinetics parameters in plasma after conversion of prednisone acetate tablets (n ＝16)

經過折算后潑尼松龍藥動學參數Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的幾何均值比值分別為96.17%、99.17%、99.66%，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區間分 別 為87.73% ～105.42%、95.90% ～102.55%、96.19% ～103.27%；潑尼松藥動學參數Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的幾何均值比值分別為105.27%、101.65%、101.88%，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區間分別為98.88%～112.09%、97.54%～105.94%、97.90%～106.02%。

3 結論與討論

3.1 血漿中潑尼松與潑尼松龍測定方法的建立

文獻報道檢測PNS、PNSL 濃度方法，主要有HPLC 法、LC-MS/MS 法、UPLC-MS/MS 和GC-MS 法等[15-19]。本研究使用的LC-MS/MS 法測定醋酸潑尼松片體內藥動學數據，同時檢測人血漿中的PNS 和PNSL 濃度，采用蛋白沉淀法，在甲醇-0.1%甲酸水做流動相條件下，梯度洗脫法可確保待測樣品完全分離，耗時短，靈敏度高，可滿足高通量同時測定PNS 及代謝產物PNSL 的要求。

3.2 醋酸潑尼松片與潑尼松龍片藥動學比較研究

對醋酸潑尼松片與潑尼松龍片主要藥動學參數Cmax、AUC0～t、AUC0～∞等進行統計學分析，經過折算后的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區間均在在可接受范圍內（80%～120%）。這說明醋酸潑尼松片在消化道的降解是迅速而完整的，同時由于血漿中PNS 和PNSL 分別等效，說明醋酸潑尼松片與相同劑量（摩爾數）的潑尼松龍片具有生物等效性，醋酸潑尼松片完全可以替換潑尼松龍片。但是醋酸潑尼松吸收的詳細情況特別是食物對醋酸潑尼松片藥動學的影響有待進一步考證。