尾靜脈注射BA/F3-JAK2V617F細胞構(gòu)建BALB/c小鼠真性紅細胞增多癥模型

石鎮(zhèn)港，夏偉，劉學(xué)武，馮璐瑤，馮超，趙丞，姜德建，信紅亞（1.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙 41008；.湖南省藥物安全評價研究中心，新藥藥效與安全評價湖南省重點實驗室，長沙 410331；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院血液科，長沙 410008）

真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）是一種Ph 陰性骨髓增生性腫瘤疾病，其全球性群體發(fā)病率為8.4×10－6[1]。PV 的主要特征為二系或三系骨髓細胞過度增殖，臨床表現(xiàn)為以紅細胞計數(shù)升高為主的二系或三系血細胞計數(shù)升高，通常伴有肝脾腫大、出血與血栓形成，末期可進展為骨髓纖維化疾病[2]。隨著JAK2V617F基因突變的發(fā)現(xiàn)，研究者對PV 的發(fā)病機制有了更深的了解，目前PV 患者中約95%存在JAK2V617F或JAK2外顯子12 號基因突變[3-4]。現(xiàn)階段研究人員主要是通過轉(zhuǎn)基因、基因敲入或注射轉(zhuǎn)染JAK2V617F突變基因細胞等方法構(gòu)建JAK2V617F突變的PV 疾病動物模型[5-8]。與注射轉(zhuǎn)染JAK2V617F突變基因細胞方法相比，轉(zhuǎn)基因及基因敲入建立PV 模型存在耗時長、成本較高等缺點，因此本研究采用尾靜脈注射JAK2V617F突變細胞，構(gòu)建BALB/c 小鼠PV 模型，模擬PV 全身播散的生物學(xué)特點，探討PV 模型建立方法以及細胞量對PV 動物模型建立的影響，為今后研究PV 治療提供模型基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物及預(yù)處理

SPF 級BALB/c小鼠40只，雌性，5 ～6 周齡[湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2011-0003；飼養(yǎng)于湖南省藥物安全評價研究中心屏障環(huán)境，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2015-0016]。所購小鼠于SPF 級動物房內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)1 周，標準顆粒飼養(yǎng)，飲水、墊料及一切與鼠接觸的物品均經(jīng)滅菌處理。接種前動物接受1.0 Gay 劑量的全身輻照，預(yù)處理后24 h 內(nèi)尾靜脈接種細胞。

1.2 試藥與儀器

BA/F3 完全培養(yǎng)基、BA/F3 細胞（上海復(fù)祥生物科技有限公司）；JAK2V617F質(zhì)粒（載體為pCDH-CMV-MCS-COpGFP-T2A-Puro）、空白載體質(zhì)粒及慢病毒（武漢中邁盈科生物科技有限公司構(gòu)建并包裝）；磷酸蘆可替尼片（AG，規(guī)格：5 mg/片，批號：SCU66）；BC-5800 型五分類血液細胞分析儀（深圳邁瑞公司）；ME2002E 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；RM2235 型石蠟切片機、TP1020 型全自動脫水機、ED1150H ＋C 型組織包埋機、DFC420C 病理成像系統(tǒng)、DM2000 型生物顯微鏡（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 實驗分組及給藥方法

BA/F3 細胞復(fù)蘇后置于含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基（含10 ng·mL－1的白介素3）中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ～3 d 換液傳代一次。收集對數(shù)生長期細胞分別進行JAK2V617F慢病毒和空白載體質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選JAK2V617F慢病毒、空白載體質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染成功的細胞進行傳代培養(yǎng)，細胞命名為BA/F3-JAK2V617F、BA/F3-Blank。雌性BALB/c 小鼠40只，隨機分為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、蘆可替尼組，每組8 只。低劑量組、中劑量組、高劑量組、蘆可替尼組分別經(jīng)尾靜脈注射密度為1×106、5×106、8×106、8×106個·mL－1的BA/F3-JAK2V617F細胞，0.2 mL/只，空白對照組尾靜脈注射密度為8×106個·mL－1的BA/F3-Blank 細胞，0.2 mL/只，每日將蘆可替尼配制成質(zhì)量濃度為0.26 mg·mL－1的藥液按20 mL·kg－1進行灌胃給藥，空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組給予等體積純水，每日給藥1 次，連續(xù)給藥4 周。

2.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)意義的水平設(shè)定為P≤0.05，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，用Leven’s test 方法檢驗正態(tài)性和方差齊性，如果符合正態(tài)性和方差齊性，用單因素方差分析（ANOVA）和LSD test 進行統(tǒng)計分析；如果不符合正態(tài)性和方差齊性，則用Kruskal-Wallis 檢驗，如果Kruskal-Wallis 檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.05），則用Dunnett’s test（非參數(shù)方法）進行比較分析，評價時考慮統(tǒng)計學(xué)差異和生物學(xué)意義。

2.3 觀察指標

2.3.1 血液學(xué)指標 末次給藥后，各組小鼠眼底靜脈叢采血，0.2 mL/只，檢測血液中白細胞（WBC）、紅細胞（RBC)、血紅蛋白（HGB）、紅細胞比容（HCT）。

2.3.2 脾臟質(zhì)量及脾指數(shù) 末次給藥后，各組小鼠頸椎脫臼處死，解剖取脾臟并稱重，按以下公式計算脾指數(shù)。

脾指數(shù)（mg·g－1）＝脾臟濕重（mg）/體質(zhì)量（g）

2.3.3 骨髓涂片 解剖取胸骨，用鑷子擠壓胸骨，直至擠壓出骨髓，對骨髓進行骨髓涂片，光鏡下觀察有核細胞計數(shù)變化。

2.3.4 組織病理學(xué)變化 解剖取脾臟、胸骨、股骨、腰椎，10%福爾馬林固定，作組織病理學(xué)檢查。

3 結(jié)果

3.1 血液學(xué)指標變化

如表1所示，與空白對照組比較，低劑量組HGB 明顯升高（P≤0.01），中劑量組、高劑量RBC、HGB、HCT 均明顯升高（P≤0.01），高劑量組RBC、HGB、HCT 顯著高于低劑量組和中劑量組。與高劑量組比較，蘆可替尼組RBC、HGB、HCT 均明顯降低（P≤0.01）。

表1 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對血液學(xué)指標的影響( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the hematology indexes ( ±s，n ＝8)

表1 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對血液學(xué)指標的影響( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the hematology indexes ( ±s，n ＝8)

注：與空白對照組比較，##P ≤0.01；與高劑量組比較，**P ≤0.01。Note：Compared with the blank control group，##P ≤0.01；compared with the high dose group，**P ≤0.01.

組別 濃度/（個·mL－1） WBC/（×109·L－1） RBC/（×1012·L－1） HGB/（g·L－1） HCT/%空白對照組 8.0×106 8.76±1.17 6.71±0.83 140±11 47.3±4.3低劑量組 1.0×106 8.80±0.91 7.18±1.02** 166±19##** 49.1±3.1**中劑量組 5.0×106 8.56±1.02 10.50±1.88##** 195±14##** 58.3±5.0##**高劑量組 8.0×106 9.19±1.08 12.95±1.54## 222±23## 66.1±6.8##蘆可替尼組 8.0×106 9.28±0.92 6.98±0.85** 149±18** 49.4±5.1**

3.2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對脾臟質(zhì)量及脾指數(shù)的影響

如表2及圖1所示，與空白對照組比較，其余各組體質(zhì)量明顯下降（P≤0.05 或P≤0.01），中、高劑量組脾臟質(zhì)量、脾指數(shù)明顯增大（P≤0.01）。與高劑量組比較，低、中劑量組及蘆可替尼組體質(zhì)量均明顯升高（P≤0.01），脾臟質(zhì)量、脾指數(shù)均明顯降低（P≤0.05 或P≤0.01）。

表2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對體質(zhì)量、脾臟、脾指數(shù)的影響( ±s，n ＝8)Tab 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the body mass，spleen and spleen index ( ±s，n ＝8)

表2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對體質(zhì)量、脾臟、脾指數(shù)的影響( ±s，n ＝8)Tab 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the body mass，spleen and spleen index ( ±s，n ＝8)

注：與空白對照組比較，#P ≤0.05，##P ≤0.01；與高劑量組比較，*P ≤0.05，**P ≤0.01。Note：Compared with the blank control group，#P ≤0.05，##P ≤0.01；compared with the high dose group，*P ≤0.05，**P ≤0.01.

組別 濃度/（個·mL－1） 體質(zhì)量/g 脾臟質(zhì)量/mg 脾指數(shù)/（mg·g－1）空白對照組 8.0×106 29.5±0.7 163±15 5.5±0.5低劑量組 1.0×106 28.5±1.5#** 175±19** 6.2±0.6#**中劑量組 5.0×106 25.5±1.0##** 202±38##* 7.9±1.5##**高劑量組 8.0×106 21.9±1.0## 225±17## 10.3±0.5##蘆可替尼組 8.0×106 28.0±0.6##** 170±17** 6.1±0.6**

圖1 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對脾臟的影響Fig 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the spleen

3.3 BA/F3-JAK2V617F 細胞對骨髓中有核細胞的影響

如表3所示，與空白對照組比較，其余各組骨髓中粒細胞系、粒紅比明顯減少（P≤0.05 或P≤0.01），中劑量組、高劑量組、蘆可替尼組紅細胞系明顯增加（P≤0.05 或P≤0.01）。與高劑量組比較，蘆可替尼組粒紅比明顯增加，紅細胞系明顯減少（P≤0.01）。

表3 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對骨髓中有核細胞的影響( ±s，n ＝8)Tab 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the nucleated cells in bone marrow ( ±s，n ＝8)

表3 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細胞對骨髓中有核細胞的影響( ±s，n ＝8)Tab 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the nucleated cells in bone marrow ( ±s，n ＝8)

注：與空白對照組比較，#P ≤0.05，##P ≤0.01；與高劑量組比較，*P ≤0.05，**P ≤0.01。Note：Compared with the blank control group，#P ≤0.05，##P ≤0.01；compared with the high dose group，*P ≤0.05，**P ≤0.01.

組別 濃度/（個·mL－1） 粒細胞系/% 紅細胞系/% 粒紅比 巨核細胞/個空白對照組 8.0×106 53.5±2.8 33.5±2.7 1.6±0.2 22.5±2.4低劑量組 1.0×106 48.6±3.9#* 36.3±2.7** 1.3±0.1#** 22.8±2.5中劑量組 5.0×106 45.4±2.7## 41.3±2.7##** 1.1±0.1## 24.8±1.3高劑量組 8.0×106 42.8±6.8## 47.9±7.5## 0.9±0.3## 23.6±2.7蘆可替尼組 8.0×106 46.9±5.2## 38.6±6.3#** 1.3±0.3##** 23.5±2.4

3.4 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對脾臟、腰椎、股骨、胸骨組織病理學(xué)影響

如圖2～5 所示，空白對照組小鼠脾臟、腰椎、股骨、胸骨無明顯病理變化；低劑量組脾臟、腰椎、股骨無明顯病理變化，胸骨中骨髓造血活躍，紅系造血細胞稍增多；中劑量組腰椎無明顯病理變化脾臟髓外造血，紅系造血細胞明顯增多，胸骨骨髓造血活躍，紅系、粒系造血細胞均明顯增多；股骨骨髓造血活躍，紅系造血細胞稍增多，高劑量組脾臟髓外造血，紅系造血細胞明顯增多，腰椎、股骨、胸骨骨髓造血活躍，紅系、粒系造血細胞均明顯增多；蘆可替尼組脾臟、股骨、腰椎均無明顯異常，胸骨骨髓造血活躍，紅系造血細胞稍增多。

圖2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對脾臟組織病理學(xué)影響（200×）Fig 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the histopathology of the spleen（200×）

圖3 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對腰椎組織病理學(xué)影響（200×）Fig 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the histopathology of lumbar spine（200×）

4 討論

圖4 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對股骨組織病理學(xué)影響（200×）Fig 4 Effect of different BA/F3-JAK2V617F cell concentrations on histopathology of femur（200×）

圖5 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對胸骨組織病理學(xué)影響（200×）Fig 5 Effect of different BA/F3-JAK2V617F cell concentrations on histopathology of sternum（200×）

與人類疾病相似性高的動物模型是進行藥效學(xué)與藥理學(xué)研究的實驗基礎(chǔ)，腫瘤動物模型建立的首要步驟是防止動物的免疫系統(tǒng)將移植的腫瘤細胞殺死。本研究采用1.0 Gay 射線全身照射的方式破壞小鼠的免疫系統(tǒng)，并在輻照24 h 內(nèi)注射不同濃度的BA/F3-JAK2V617F細胞建立PV 模型，探索不同濃度的BA/F3-JAK2V617F細胞對模型建立的影響。研究結(jié)果表明，尾靜脈注射中、高劑量BA/F3-JAK2V617F細胞后小鼠各項生物學(xué)指標結(jié)果與臨床PV 患者表現(xiàn)的HGB、RBC、HCT 增多、脾臟腫大、髓外造血、骨髓粒、紅與巨核細胞系增生活躍等生物學(xué)特點相似[9-11]。且蘆可替尼作為JAK2 激酶抑制劑，臨床常用于治療PV 繼發(fā)的骨髓纖維化以及對羥基脲無應(yīng)答或不耐受的PV 患者[12]。在本研究中蘆可替尼能明顯抑制PV模型小鼠血液中RBC、HGB、HCT 的增加，降低脾臟重量與脾指數(shù)，抑制骨髓中的紅細胞系增多，并能顯著抑制脾臟造血紅細胞以及腰椎、股骨、胸骨紅系、粒系造血細胞的增多。以上指標表明BALB/c 小鼠經(jīng)尾靜脈注射1.0×106～1.6×106個·mL－1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BA/F3-JAK2V617F細胞后可構(gòu)建PV 模型，能較好地模擬PV 在體內(nèi)的發(fā)展過程，為尋找新的治療方案提供一定基礎(chǔ)。