利培酮治療對不同性別精神分裂癥發育模型小鼠行為學的影響

楊洋，楊靜靜，丁閃，唐亞梅，劉勇*（.中南大學湘雅二醫院檢驗科，長沙 400；.中南大學湘雅二醫院精神衛生研究所，長沙 400）

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一種嚴重的精神疾病，臨床上主要以思維、情感和行為的分裂以及精神活動與環境不協調為主要特征，發病率和致殘率高，確切發病機制未明。利培酮（risperdone，RIS）是近年來臨床上廣泛使用的一種非典型抗精神病藥物，為多巴胺D2受體和5-羥色胺2A（5-HT2A）受體雙重拮抗劑，長期用藥可引起血清催乳素的升高，導致骨質疏松、泌乳、女性閉經或月經紊亂等[1]。國內外SZ 動物模型研究大多使用雄鼠，而雌鼠的相關研究報道較少，可能是因為雌鼠有生理周期，體內激素和酶的水平不穩定，對外界刺激也比較敏感，行為學不如雄鼠穩定等。本研究擬以近交系C57BL/6 小鼠為研究對象，在神經發育的關鍵期——圍產期，采用非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽（MK-801）重復處理，建立不同性別的SZ 發育小鼠模型；并予以RIS 干預SZ 發育模型小鼠；初步探討RIS 干預下不同性別SZ 發育模型小鼠的自發活動和社會交往行為變化，為進一步在細胞和分子水平上研究RIS 致血清催乳素升高的病理機制奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級，新生C57BL/6 小鼠，體質量1 ～2 g，共60 只，雌雄各半（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），小鼠飼養于動物房中，維持室溫在（24±2）℃，濕度50%～60%，采用12 h 晝夜節律7：00 ～19：00；所有實驗都在8：00 ～17：00 完成。

1.2 試藥

MK-801、利培酮（美國Sigma Aldrich 公司，純度均＞98%）。冰乙酸、氫氧化鈉（NaOH）（國藥集團化學試劑有限公司）。

MK-801 溶于滅菌生理鹽水（NS）中，配成0.06 mg·mL－1溶液，分裝儲存于－70℃冰箱備用。氫氧化鈉溶解于雙蒸水中配成1 mol·L－1的NaOH 溶液。RIS 溶解于含1 μL·mL－1冰乙酸的雙蒸水中，用1 mol·L－1NaOH 溶液調節pH 至6.0，配成0.03 mg·mL－1的溶液，現用現配。所有藥物和生理鹽水均按照10 mL·kg－1腹腔注射。

1.3 儀器

電子天平（SF-400C 貝意克設備技術有限公司，安徽），分析天平（METTLER AE240，瑞士），pH 計（MTTLER TOLEDO De1ta320，瑞士），數碼攝像機（Sony DCR-HC40E，日本），曠場實驗測試系統（ENV 515，Med Associates Inca Vermont，USA），社會交往實驗測試箱（自制）。

2 方法

2.1 動物分組及處理

60 只來自15 窩新生C57BL/6 小鼠，雌雄各半，按性別分為兩大組，每大組又隨機分為對照組、模型組（Model）和RIS 治療組，每組10只。各組仔鼠于P7 ～11 d 每日稱重一次，模型組和RIS 治療組于P7 d 腹腔注射0.6 mg·kg－1的MK-801 腹腔注射，對照組以NS 平行處理，注射體積為10 mL·kg－1，每日8：00 ～9：00注射1 次，連續注射5 d，仔鼠于P21 d 斷奶。P45 ～59 d 各組小鼠每日稱重一次，RIS 治療組于P45 d 腹腔注射0.3 mg·kg－1RIS，對照組和模型組小鼠以NS 平行處理，注射體積為10 mL·kg－1，每日1 次，連續注射15 d。P60 d 開始進行曠場實驗和社會交往實驗。

2.2 自發活動測試

自發活動測試是一種用來評價實驗動物（主要指大鼠和小鼠）在新環境中的自發活動水平、緊張焦慮狀態、刻板行為和探究行為等的實驗方法。自發活動測試箱為43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 規格的有機玻璃敞箱，四周安裝16×16×2的紅外線網絡跟蹤監測系統。實驗在暗光、安靜的房間內進行。實驗開始前30 min 將小鼠連同飼養籠一起轉移到行為學實驗室，使其適應實驗環境，實驗時讓小鼠自由活動10 min，測試系統自動記錄小鼠的活動情況和位置信息，通過數據采集和分析處理系統在電腦中模擬出小鼠在整個實驗過程中的運動軌跡，從而進行相應的分析。每只小鼠實驗結束后以70%乙醇清洗實驗箱。

2.3 社會交往測試

社會交往測試用于評價實驗動物的社交和回避社交功能，社交功能缺陷是SZ 的主要陰性癥狀之一。社會交往測試箱為43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 規格的有機玻璃敞箱。實驗前各組小鼠單只分籠飼養10 d，在分籠飼養的第9 ～10日，每日將單只小鼠放入社會交往測試箱中適應10 min，第10日測試箱適應完畢后，將各組小鼠同組內兩兩配對，配對小鼠的體質量差控制在2 g 以內，第11日將各組配對小鼠每次兩只同時放入社會交往測試箱中，每對小鼠的測試時間為10 min，用數碼相機記錄配對小鼠的行為并進行分析。小鼠的社會交往行為主要分為兩種，即攻擊性行為和非攻擊性行為，攻擊性行為包括與配對小鼠的撕咬、踢打、摔跤和拳擊等行為，非攻擊性行為包括與配對小鼠的社交性玩耍、聞嗅、理毛和尾隨等行為。評價指標為非攻擊性行為百分比，非攻擊性行為百分比＝非攻擊性行為時間/（非攻擊性行為時間＋攻擊性行為時間）×100%。

2.4 統計學處理

所有數據采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據處理和統計分析。曠場實驗和社會交往實驗數據不同性別間比較采用獨立樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差分析存在統計學意義時，進一步兩兩比較采用Levene 方差齊性檢驗，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane’sT2檢驗，數據用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 RIS 治療對不同性別SZ 發育模型小鼠自發活動的影響

如表1所示，與對照組比較，雄性或雌性模型組小鼠、RIS 治療組小鼠自發活動總路程均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，雄性或雌性RIS 治療組小鼠自發活動總路程均顯著減少（P＜0.05）。各組組內雄性小鼠與雌性比較，自發活動總路程顯著增加（P＜0.05）。

表1 各組不同性別SZ 發育模型小鼠自發活動總路程的比較Tab 1 Total distance of spontaneous activities in SZ developmental model mice of different sex groups

3.2 RIS 治療對不同性別SZ 發育模型小鼠社交功能的影響

如表2所示，與對照組比較，雄性或雌性模型組小鼠社會交往時間、非攻擊性行為百分比均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），雄性或雌性RIS 治療組均無顯著性差異（P＞0.05）；與模型組比較，雄性或雌性RIS 治療組小鼠社會交往時間、非攻擊性行為百分比均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。各組組內雄性小鼠與雌性比較，社會交往時間無顯著性差異（P＞0.05），而非攻擊性行為百分比顯著增加（P＜0.05）。

表2 各組不同性別SZ 發育模型小鼠社會交往功能的比較Tab 2 Social communication function of SZ developmental model mice of different sex groups

4 討論

SZ 的病因及發病機制復雜，涉及到遺傳、環境、社會和心理學等諸多因素。SZ 的臨床治療及康復效果并不理想，由于倫理學、安全性以及SZ 臨床研究手段的局限性，對SZ 病因和病理機制的研究一直未取得突破性的進展。C57BL/6 小鼠是近交系小鼠，應激反應均一，實驗結果精度好，可比性強，被廣泛用于遺傳學、免疫學和生理學等研究，因此本研究選用C57BL/6 近交系小鼠，建立高效度的嚙齒類SZ 動物發育模型，研究SZ 相關的癥狀學、病因學及藥理學機制。目前SZ 動物模型構建多以SZ 的谷氨酸功能紊亂假說為理論依據，MK-801 是一種非競爭性NMDA受體拮抗劑，其對NMDA 受體的選擇性親和力較苯環已哌啶（PCP）和氯胺酮更強，被廣泛用于SZ 動物模型構建[2]。MK-801 處理嚙齒類動物可以引起動物產生一些類似SZ 的行為學和神經生物學改變，包括自發活動增加、感覺門控缺陷、社交和學習記憶功能缺陷等，并且一些行為學和神經生物學改變可以被典型或非典型抗精神病藥所改善[3]。RIS 是近年來臨床上使用比較多的非典型抗精神病類藥物，盡管其克服了典型抗精神病藥物的許多不足，但由于其作用于中樞神經系統的基礎神經通路，可能引起女性患者的內分泌功能失調，如血清催乳素升高導致的泌乳、骨質疏松、女性月經紊亂和閉經等不良反應[4]。雖然雌鼠有生理周期，體內激素和酶的水平波動較大，行為學不如雄鼠穩定，建立SZ 動物模型存在不足，但鑒于上述與性別相關的病理改變，有必要開展雌性和雄性SZ 動物模型的比較研究，以期為SZ 性別相關的病理學研究提供可靠的實驗依據。

曠場實驗是可觀察自然狀態下嚙齒類動物在新異環境中的活動情況，主要用來評價動物的中樞興奮狀態、運動功能、探索行為、緊張度和情緒反應等[5]。實驗動物在曠場實驗中自發活動總路程增加表示實驗動物中樞興奮性增加。本研究中MK-801 誘導的SZ 發育模型小鼠（雄性或雌性）自發活動總路程較對照組均顯著增加，表明SZ 發育模型組小鼠的中樞興奮性增加，這與既往研究報道一致[6]。RIS 治療組小鼠自發活動總路程較SZ 發育模型組顯著減少，表明非典型抗精神病藥物RIS 給藥改善了SZ 發育模型小鼠的自發活動增加。研究表明MK-801 誘導的小鼠自發活動增加與NMDA 受體阻斷觸發的中腦邊緣尤其是伏核部多巴胺的釋放增加有關，然而一些單胺類遞質缺乏的SZ 動物模型也表現出自發活動增加，因此MK-801 誘導的小鼠自發活動增加可能涉及大腦多個神經遞質系統[7]。有研究表明，自發活動的增加與大腦谷氨酸、γ-氨基丁酸和多巴胺等遞質系統的相互作用密切相關[8]。本研究各組雄性小鼠的自發活動總路程明顯大于同組的雌鼠，表明不同性別小鼠的自發活動能力存在差異，雌性小鼠相對比較安靜少動，而雄性小鼠多動，喜歡打斗，活動能力較強。雌鼠存在生理周期，其體內激素和酶的代謝水平不穩定，對藥物的反應性也有不同，這些因素可能導致了自發活動的差異，但究竟哪種機制發揮主要作用目前仍不清楚，可能是多種途徑共同作用的結果，具體原因有待進一步深入研究。

社交功能缺陷是SZ 陰性癥狀的主要表現之一，SZ 患者往往有多種社會功能障礙，社交功能缺陷與SZ 的異質性和疾病進展有關[9]。臨床研究表明，NMDA 受體拮抗劑可以誘導嚙齒類、靈長類和人類出現社交功能損害[10]，并且社交功能損害可以被一些抗精神病藥物所逆轉。NMDA 受體拮抗劑誘導的社交功能損害可能與前額葉皮質區的5-HT 和多巴胺遞質系統功能紊亂有關，主要表現為前額葉皮質區5-HT 系統較多巴胺系統功能活動增強[11]。本研究社會交往實驗中，正常對照組、SZ 發育模型組及RIS 治療組各組小鼠的總活動時間比較無顯著性差異，表明MK-801 和RIS 處理對小鼠總體活動水平無明顯影響。SZ 發育模型組小鼠社會交往時間較正常對照組顯著減少，RIS 治療組小鼠社會交往時間與正常對照組比較無顯著性差異，RIS 治療組小鼠社會交往時間較SZ 發育模型組增加，表明SZ 發育模型組小鼠成年后社交行為明顯減少，0.3 mg·kg－1RIS可以完全逆轉MK-801 誘導的小鼠社交行為減少。各組社交行為中非攻擊性行為百分比也不同，SZ發育模型組小鼠的非攻擊性行為百分比顯著小于正常對照組，而RIS 治療組小鼠的非攻擊性行為百分比與正常對照組接近，顯著高于SZ 發育模型組，表明圍產期MK-801 重復處理小鼠可致小鼠成年后社交行為中攻擊性行為增加，非典型抗精神病藥RIS 可以逆轉MK-801 誘導的小鼠攻擊性行為增加，與Wang 等[12-13]用NMDA 受體拮抗劑PCP 處理動物的結果一致。本研究中各組雄性小鼠的非攻擊性行為百分比均顯著低于同組雌鼠，表明雄性小鼠社會交往行為中的攻擊性行為較雌性小鼠顯著增加，由于雌性與雄性小鼠激素及代謝水平等的差異，雌性小鼠性情溫和，通常較少發生打斗現象，而雄性小鼠通常無法和平相處，時常打斗，所以各組雄性小鼠的攻擊性行為較雌鼠均顯著增多。綜上可見，圍產期MK-801重復處理誘導的SZ 發育模型雌性小鼠與雄性模型小鼠比較，雖存在行為學的顯著差異，但SZ雌性模型小鼠與雄性小鼠類似，存在明顯的自發活動和社交功能損害，可部分模擬SZ 的陽性和陰性癥狀，作為SZ 雄性動物模型的有效補充，可用于SZ 性別相關的病理機制研究。本研究中RIS 給藥一定程度逆轉了MK-801 誘導的小鼠自發活動增加和社交功能損害，這可能與RIS 對D2受體、5-HT2A受體、腎上腺素α1受體等的拮抗作用有關，介導這些行為改變的神經機制復雜，有待進一步的研究探索其作用途徑和過程。