間接ELISA法檢測大鼠血清中抗埃博拉病毒雙特異性抗體MBS77E濃度及大鼠體內藥代動力學研究

相亞楠，高尤，馮健男，張文鵬*，莊笑梅*（1.天津大學，天津 30007；.軍事醫學研究院，北京 100850）

埃博拉病毒（EBOV，Ebola virus）作為烈性病毒屬于絲狀病毒科[1]，可引起人類和靈長類動物產生埃博拉病毒病，具有潛伏期長、傳播途徑廣、感染種群復雜、毒性大和致死率高等特點[2-5]。

自2014年西非埃博拉疫情爆發以來，基于“同情性用藥”原則，在緊急狀態下ZMapp 被批準用于埃博拉出血熱患者的治療。ZMapp 由c2G4、c4G7 和c13C6 共3 個嵌合抗體組成[6]，它們的母本抗體均是從免疫小鼠中篩選獲得，經嵌合改造將ZMapp 恒定區替換為人IgG1 的Fc[7-12]，分別識別EBOV 表面的GP-1 蛋白、GP2 蛋白和sGP 蛋白。通過阻斷EBOV 病毒表面抗原與宿主細胞表面受體相互作用，介導抗體依賴細胞介導的細胞毒效應等免疫效應，發揮其抗病毒作用。

MBS77E 是軍事醫學研究院在ZMapp 的c13C6和c2G4 抗體基礎上改造的雙特異性抗體，通過工程化改造的中國倉鼠卵巢細胞表達而來，并且將兩個抗體融合成一個分子，便于生產、給藥方便，MBS77E 體內真病毒攻毒實驗結果優于ZMapp[13]。該抗體抗病毒效果良好，已進入臨床前研究。目前針對生物基質中抗體藥物的定量檢測方法有同位素示蹤法、ELISA 法、HPLC 法和LC-MS/MS 法。同位素示蹤法實驗過程繁瑣，且同位素的使用有較嚴格的要求；HPLC 法適用于制劑產品分析，用于生物樣品分析時，靈敏度和選擇性都不夠；LC-MS/MS 法的條件優化過程復雜，且費用昂貴[14-17]。

本研究擬建立特異、敏感、簡便、高通量、重復性好的間接 ELISA 法定量測定大鼠血清中MBS77E，并對其在大鼠體內藥代動力學進行研究。

1 材料

1.1 試藥與儀器

MBS77E 單克隆抗體（浙江海正藥業，質量濃度4.5 mg·mL－1，批號：190410）；大鼠空白血清（北京維通利華實驗動物技術有限公司，批號：190825）；GP-1 蛋白（軍事醫學研究院，質量濃度2.2 mg·mL－1，批號：190410）；羊抗人IgGHRP（Sera care 公司，貨號：5220-0330）；TMB 顯色液（四甲基聯苯胺，Invitrogen 公司，貨號：00-4201-56）；包被緩沖液（pH 9.6 碳酸鹽緩沖液，自制）；洗滌液（pH 7.4 的PBST 溶液，自制）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，貨號：C10010500BT，Gibco 公司）；脫脂奶粉封閉液（貨號：232100）；促凝管（添加SST Amber 高分子凝膠促凝）（美國BD 公司）；酶標儀（德國BMG LABTECH 公司）；微量加樣器（德國Eppendorf 公司）；離心機、96 孔板（美國Thermo 公司）；微量振蕩器（美國 SCILOGEX 公司）；電子天平（德國賽多利斯儀器系統有限公司）；洗板機（北京天石天力醫療器械技術開發中心公司）；Human-IgG（中國Solarbio公司，批號：20190705）。

1.2 實驗動物

SD 大鼠15 只，雄性，SPF 級[北京維通利華實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006]；年齡6 周，體質量0.20 ～0.22 kg，實驗期間動物自由取食、飲水，所有操作均符合實驗動物倫理委員會規定（IACUC-DWZX-2020-627）。

2 方法

2.1 間接ELISA 法建立

2.1.1 溶液配制 用SD 大鼠空白血清稀釋MBS77E成質量濃度為0.049、0.098、0.195、0.390、0.780、1.560、3.125、6.25、12.50、25.00 μg·mL－1的對照品。同法配制高（QCH）、中（QCM）、低（QCL）10.00、0.25、0.195 μg·mL－1的MBS77E 質控樣品。

2.1.2 檢測步驟 用包被緩沖液將GP-1 抗原稀釋到1 μg·mL－1，加入96 孔酶聯板中，每孔100 μL，4℃包被過夜。每孔加入200 μL 脫脂奶粉封閉液，37℃孵育1 h。每孔加入100 μL 待測樣品，設置復孔，37℃孵育2 h。用二抗稀釋液按1∶100 000 稀釋HRP 標記的羊抗人IgG，每孔加入100 μL，37℃避光孵育1 h。加入TMB 顯色液，室溫避光放置10 min。最后加入1 mol·L－1的H2SO4終止反應，用酶標儀于450 nm 波長處測定OD值。

2.1.3 數據處理 將樣品濃度（X）與吸光度（Y）利用 SPECTRO starNano軟件的四參數法進行擬合，得到四參數擬合方程為：Y＝Bottom ＋（Top-Bottom）/[1 ＋（EC50/X）^Slope]。其中Top 為擬合曲線上端漸進線的估計值（OD值），Bottom 為擬合曲線下端漸進線的估計值（OD值），Slope 為校正曲線的斜率，X為實測濃度，EC50為50%光吸收值所對應的樣品濃度值，通過擬合最優的曲線作為校正曲線。

2.1.4 方法學驗證 按照生物樣品指導原則要求，進行特異性、精密度、準確度、選擇性、稀釋線性、鉤狀效應、平行性和穩定性等全面驗證。

2.2 藥代動力學實驗

2.2.1 給藥方案 SD 大鼠隨機分為3 組，每組5 只，MBS77E 給藥劑量分別為0.5、10.0、50.0 mg·kg－1（用PBS 稀釋）。

2.2.2 血清樣品的制備 SD 大鼠單次靜脈注射，于給藥開始后10 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d 靜脈采血約200 μL，置于促凝離心管中。全部血樣均于室溫凝固30 min 后，4℃、2500 g 離心10 min 獲得血清，分裝后于－40℃凍存，待測。

2.2.3 數據處理 用WinNonlin 軟件，按非房室統計矩模型計算靜脈推注給藥后SD 大鼠的主要藥代動力學參數曲線下面積（AUC）、清除率（CL）、穩態表觀分布容積 （Vss）、消除半衰期（t1/2）和平均駐留時間（MRT）。采用 Microsoft EXCEL（2010）計算均值、標準差（SD），使用 GraphPad Prism 6作圖。采用 Microsoft EXCEL（2010）對各組間t1/2和CL進行t檢驗比較。

3 結果

3.1 ELISA 檢測方法的建立與驗證

3.1.1 標準曲線 用大鼠空白血清配制MBS77E單克隆抗體0.098、0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5 μg·mL－18 個質量濃度，用酶標儀進行測定吸光度值，質量濃度的對數值與吸光值（OD值）呈S 形曲線，通過擬合誤差最小的曲線作為校正曲線。代表性擬合曲線見圖1。

圖1 MBS77E 單克隆抗體大鼠血清四參數擬合標準曲線Fig 1 Standard curve of MBS77E in rat serum obtained by 4 parameter fitting method

3.1.2 特異性 為了確定相關基質是否對MBS77E的檢測有干擾，需要進行特異性考察。分別做不同濃度Human-IgG 對MBS77E 單克隆抗體校正標準曲線的影響，結果顯示兩者無交叉反應，特異性良好（見表1）。

表1 加入不同劑量Human-IgG 干擾后MBS77E 的質量濃度 (Mean±SD，n ＝5)Tab 1 Concentration of MBS77E after the intervening with different doses of Human-IgG (Mean±SD，n ＝5)

3.1.3 準確度和精密度 制備低、中、高3 個質量濃度（0.195、0.25、10.00 μg·mL－1）MBS77E單克隆抗體，按“2.1.2”項下方法同樣測定，每塊板5 個復孔，平行操作6 批，計算板間與板內的精密度。板內精密度在5.3% ～11.3%波動，板間精密度在3.0% ～11.1%波動，均符合生物樣品方法學原則中的要求。

3.1.4 稀釋線性與鉤狀效應（HOOK 效應） 預實驗結果提示MBS77E 在大鼠體內藥代動力學實驗中實際血清樣品濃度較高，超出了標曲定量范圍，需要進行稀釋，因此對血清樣品的稀釋準確度進行考察，而抗體濃度過高時可能出現抗原抗體比例不合適而導致假陰性現象，因此需要考察鉤狀效應[18]。用大鼠混合空白血清將MBS77E溶液（4.5 mg·mL－1）稀釋成3 個質量濃度的（100、1000、2000 μg·mL－1）鉤狀效應樣本，然后分別稀釋至1 μg·mL－1作為稀釋線性樣本進行驗證。鉤狀效應樣本最高質量濃度選擇2000 μg·mL－1是因為MBS77E 大鼠實際給藥時血藥濃度為2000 μg·mL－1。結果表明：大鼠血清樣品分別稀釋100 倍、1000 倍、2000 倍后，準確度分別為83.1%、80.4%、82.4%；精密度分別為0.04%、0.25%、0.001%。稀釋不會對樣品的測定結果造成影響，鉤狀效應樣本的OD值與標準曲線高點響應一致，表明該濃度范圍內無明顯的鉤狀效應。

3.1.5 平行性 選取3 個真實樣本，用空白大鼠混合血清分別稀釋（1000、2000、5000 倍）至標準曲線范圍內。結果表明，3 個樣本的RSD分別為5.8%、7.0%和5.3%，不會對樣品的準確度造成影響。

3.1.6 選擇性 取10 只不同大鼠空白血清樣本，每只大鼠血清均制備一個空白樣本，一個定量下限（LLOQ）濃度水平樣本，一個QCH 濃度水平樣本。結果10 個空白大鼠血清樣本回算濃度均低 于LLOQ，MIL94抗體的LLOQ 與QCH 濃度水平的血清樣本檢測的準確度（實測值/理論值×100%）分別為104.1% 和91.3%，滿足生物樣品分析方法驗證的要求。

3.1.7 穩定性 在QCL、QCH 的質控樣本配制即刻（C0）、常溫放置4 h、－40℃放置14、28、56 d 及反復凍融3 次、5 次后（每個濃度水平3個樣本）測定，結果每個濃度至少67%樣本的實測值在其理論值80%～120%內，滿足生物樣品分析方法驗證的要求。

3.2 大鼠體內血藥濃度-時間曲線及藥代動力學參數

用WinNonlin 軟件，按非房室統計矩模型計算靜脈給藥后大鼠的主要藥代動力學參數，結果提示，MBS77E 大鼠靜脈給藥后，3 組動物給藥劑量比為1∶20∶100，體內暴露量AUC比為1∶24∶154，給藥劑量與暴露量基本成正比；中、高劑量半衰期差異無統計學意義，Vss與大鼠血清容量一致。綜合分析，在0.5 ～50.0 mg·kg－1劑量內，MBS77E 在大鼠體內的藥物基本呈線性動力學消除（見圖2及表2）。

圖2 大鼠靜脈注射MBS77E 的平均血清藥-時曲線（Mean±SD，n ＝5）Fig 2 Mean serum concentration-time curves of MBS77E in rats after 3 doses of MBS77E were intravenously injected（Mean±SD，n ＝5）

表2 大鼠靜脈注射MBS77E (0.5、10.0、50.0 mg·kg－1) 3 個劑量后主要藥代動力學參數(Mean±SD，n ＝5)Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of MBS77E in rats after 3 doses of MBS77E intravenously injected (Mean±SD，n＝5)

4 結論與討論

針對埃博拉出血熱預防和治療在研藥物主要集中在疫苗、中和抗體、小分子抗病毒藥物、RNA 干擾藥物和核苷酸類藥物5 個重要研究方向?？贵w藥物安全性高、不良反應小，比抗病毒藥物的特異性強[19-20]。同時，相較于疫苗需要提前注射、主要發揮預防效果，抗體藥物具有在感染后給藥，針對性治療等優點。這些特點使其具有明顯優勢，大量研究機構都在進行抗埃博拉抗體的研究。因此，開發一種可用于評價體內抗體濃度的簡單、快速的檢測方法非常重要。

方法開發時，檢測條件、試劑等的選擇優化十分重要。例如，未結合的抗原會影響空白樣品的響應（背景值），在洗滌液中添加表面活性劑Tween-20可以增加洗脫能力，除去未結合的抗原。經過不斷優化Tween-20 的比例，發現添加0.2%Tween-20時洗滌效果最好，且不影響最終響應值。另外，封閉液在封閉過程中起到占位作用，封閉液封閉不完全可能會導致檢測體系內的抗體或其他蛋白分子之間、蛋白與96 孔板壁之間發生非特異性結合，影響測量結果。因此，嘗試了脫脂奶粉、酪蛋白溶液以及兩種物質不同比例混合等封閉條件。結果表明10%脫脂奶粉封閉效果最佳。此外，不同品牌的羊抗人IgG-HRP 與抗原抗體復合物結合強弱的不同都會影響測量結果，曾嘗試了Solarbio、Invitrogen、Sera care、ABclonal 等多個品牌不同稀釋倍數的二抗。經過比較發現，部分品牌的二抗不能與抗原抗體復合物產生足夠特異性結合。而Sera care 二抗在本方法中響應良好，使用時按1∶100 000 比例稀釋時檢測效果最好。最終結果表明，本方法測定大鼠血清中MBS77E能滿足臨床前藥代動力學研究要求，可用于測定大鼠血清中MBS77E 濃度。

大鼠靜脈注射0.5、10.0 和50.0 mg·kg－1的人源化雙特異性抗體MBS77E 后，體內的藥代動力學特征顯示中、高劑量間t1/2與CL差異無統計學意義，而低劑量t1/2與中、高劑量t1/2有差異，推測可能的原因為低劑量給藥時，新生兒Fc 受體未被抗體飽和，Fc 受體與抗體MBS77E 結合，保護抗體不被代謝，延長了抗體的半衰期；在0.5 ～50.0 mg·kg－1給藥劑量內，其AUC與給藥劑量基本成比例；而Vss不隨給藥劑量改變，并且與大鼠血容量相當（45 mL·kg－1）[21-23]；CL很低；末端t1/2在10 d 以上。以上結果提示MBS77E 作為大分子類單抗藥物，在循環血液中分布較多，其在大鼠體內組織分布和排泄特征正在進行研究。

綜上，本文建立的間接ELISA 法測定大鼠血清中MBS77E 濃度，可滿足臨床前藥代動力學研究需求，并獲得了MBS77E 在大鼠體內的藥代動力學特征，為MBS77E 的臨床前及臨床藥代動力學系統研究提供了支持。