吉西他濱納米顆粒治療乳腺癌術后腫瘤復發和肺轉移的基礎研究

陳文煦，吳苗苗，房坤，張蕾，沈愛宗，*（.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 300；.中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）藥劑科，合肥 3000）

在所有女性癌癥中，乳腺癌的發病率和死亡率最高[1]。乳腺癌的特點是惡性程度高，預后差，易發生局部復發和遠端轉移[2-3]，而手術是消除乳腺癌患者負擔的一種重要的治療方式[4]。吉西他濱（GEM）作為一種廣譜的細胞毒性藥物，對各種類型的實體瘤均具有抗腫瘤作用[5]。但是，研究發現患者在接受手術和GEM 治療后仍然有很高的復發和肺轉移風險。例如，Earl 等[6]發現在1570例乳腺癌患者中，有486例在接受新輔助化療和隨后根治性手術治療后復發。Leyrer 等[7]發現113例接受手術和GEM 治療的乳腺癌患者中，2年內局部復發率和轉移率分別為12%和15%，5年內局部復發率和轉移率分別為21%和35%。因此，應制訂新的策略以減少手術后乳腺癌的復發和肺轉移。

GEM 是乳腺癌重要的化學治療劑[8]，但其不良反應通常會影響療效并限制臨床應用[9-10]。一些研究表明，GEM 納米顆粒可以降低GEM 的毒性，提高其治療效果[11]。例如，Mottaghitalab等[12]發現與對照組相比，GEM 納米顆粒顯著抑制腫瘤的生長。Samanta 等[13]發現使用GEM 納米顆粒可以增強對胰腺癌細胞的殺傷作用。但是，GEM 納米顆粒是否可以抑制乳腺癌術后的復發和肺轉移尚不清楚。本課題組擬開發聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）包裹GEM 形成納米顆粒（PLGA-GEM），通過體內和體外實驗研究PLGA-GEM 對乳腺癌復發和肺轉移的影響。

1 材料

1.1 試藥

雙（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸鈉（AOT，西格瑪奧德里奇，純度≥97%）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries 公司，批號：1922693）；1640液體培養基（美國Hyclone公司，批號：SH30809.01）；胰酶細胞消化液（碧云天生物技術研究所，批號：C0201）；吉西他濱（純度≥99%，美倫生物技術有限公司，批號：122111-03-9）；聚乳酸-乙醇酸共聚物（批號：18101401，LA∶-GA ＝50∶50）由山東省藥學科學院提供；四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號：No.715F0512）；CD31 抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB12063）；Ki67 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab15580）；TUNEL 檢 測試劑盒（綠色）（碧云天生物技術研究所，批號：C1088）；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究院）。

1.2 儀器

Malvern 儀器（Malvern ZS9，英國）； 掃描電子顯微鏡（Zeiss Ultra Plus，德國）；透射電子顯微鏡（JEM-2100，日本電子）；酶標儀（SpectraMax @ I3，美國MD）；熒光顯微鏡（DMI3000B，德國萊卡）。

1.3 細胞和動物

4T1 小鼠乳腺癌細胞（SCSP-5056）（中國科學院細胞研究所）。SPF 級BALB/c 小鼠，雌性，體質量：（18±2）g[山東斯科貝斯生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（魯）2016 0001]。

2 方法

2.1 PLGA-GEM 的制備

參考文獻方法制備PLGA-GEM[14]。稱取100 mg PLGA 和50 mg AOT 于15 mL 離心管中，加入5 mL 二氯甲烷，超聲充分混勻。然后，將含10 mg GEM 的250 μL 滅菌水作為內部水相，將20 mL 的1% PVA 用作外部水相。將內水相渦旋添加到油相中，將混合物用40%功率的探針超聲處理3 min（冰浴）以形成初乳。然后將初乳渦旋添加到外部水相中，將混合物用40%功率的探針超聲處理4 min（冰浴）以形成復乳。將復乳溶液轉移至50 mL 燒杯中，然后加入磁力攪拌器以100 r·min－1攪拌過夜。最后，將復乳溶液轉移至100 kD 超濾管中，用滅菌水超濾洗滌5 次，定容至10 mL，以獲得PLGA-GEM 納米顆粒。

2.2 粒度分布的確定和形態特征的測定

將稀釋后的PLGA-GEM 納米顆粒溶液置于檢測皿中，使用Malvern 儀器對樣品的水動力尺寸進行表征。用Millipore 純凈水作為空白對照進行儀器校準后，將樣品置于樣品杯中攪拌，直到儀器顯示出濃度測量值為止。每個樣品測試3 次。PLGA-GEM 納米粒子的形態通過掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）進行分析。

2.3 載藥量和包封率

將溶液攪拌過夜除去氯仿，使用100 kD 超濾管離心收集下清液，并檢測下清液中未負載的GEM 藥物量。參考文獻方法根據以下公式計算GEM 的載藥量（DL）[15]和包封率[16]（EE）：DL＝顆粒中的藥物量/顆粒重量×100%；EE＝實際載藥量/理論載藥量×100%。

2.4 體外釋放動力學

將PLGA-GEM 納米顆粒（5 mg）添加到透析袋（截留分子量8000 ～14000 Da）中，置于37℃[0.01 mol·L－1PBS（pH 7.4）＋1% SDS∶甲醇＝60∶40]混合溶液中，以100 r·min－1的速度搖動。在0.5、1、2、4、6、8、24、48、72 h 分別取透析袋外的釋放液1 mL，同時向透析袋內補充相同體積的介質，使用HPLC 分析提取的樣品。

2.5 細胞和動物培養

細胞培養于含10%FBS 和100 U·mL－1雙抗的培養液，于37℃細胞培養箱中培養，根據細胞生長狀態清洗、換液、傳代，待細胞生長穩定且處于對數期生長時進行實驗[17]。BALB/c 小鼠飼養于潔凈層流架內，室溫控制在（25±2）℃，相對濕度40%～60%。小鼠隨機分為4 組，每組8 只。小鼠植入腫瘤后未經治療的自然生長組作為對照組（Untreated 組），其余的24 只小鼠平均分為3組：腫瘤切除術（TRS）組；TRS ＋GEM 組，術后接受劑量為5 mg·kg－1的GEM 治療；TRS ＋PLGA-GEM 組，術后接受劑量為5 mg·kg－1的PLGA-GEM 治療。由于手術等因素造成10 只小鼠死亡，最終實驗小鼠為每組5 只。

2.6 細胞活力測定

使用MTT 法測試GEM 和PLGA-GEM 對4T1細胞的毒性。將4T1 細胞接種在96 孔板中（每孔5×103個細胞），待細胞生長到合適的密度后，將它們與不同濃度的藥物（0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol·L－1）孵育48 h。所有藥物制劑在48 h 后均用MTT 溶液代替，孵育4 h 后，將板中的MTT 溶液替換為二甲基亞砜（DMSO），并將96孔板振搖孵育30 min。最后，使用酶標儀來測量490 nm 波長下的光密度值（OD值）[18]。根據下式計算細胞生存率：細胞生存率＝（實驗OD值－空白OD值）/（對照OD值－空白OD值）×100%。

2.7 小鼠原位移植瘤塊的制備

將對數生長期的4T1細胞制備成單細胞懸液，并將細胞濃度調整至 1×105·mL－1，按0.1 mL/只小鼠的劑量，使用一次性無菌注射器注射至小鼠右側腋下皮下。注射前用碘酊對小鼠皮膚進行局部消毒，注射完畢后每日觀察，6 d 后皮下成瘤大小可達到80 ～100 mm3，成瘤率為100%。

2.8 腫瘤切除術

參考Chen[19]和Lu 等[20]建立的動物模型，當腫瘤大小達到80 ～100 mm3（4T1 細胞植入后第6日）時，進行TRS。使用水合氯醛（腹膜內注射）麻醉小鼠，將小鼠仰臥位放在無菌手術臺上，用75%乙醇對腋窩皮膚消毒。接著在乳房上做一個1 cm 長的切口，切除90%～95%的原發腫瘤。最后，用3-0 縫合線縫合并用碘酊涂抹傷口，保持小鼠溫暖并密切監視直到醒來。TRS 后1 周，每隔3 d 通過尾靜脈注射藥物進行治療，共治療5 次。最后一次給藥后3 d 采用脫頸法處死所有小鼠，立即解剖并稱重。在實驗過程中，每兩日測量一次小鼠的體重和腫瘤大小。

2.9 TUNEL 染色

根據試劑盒說明書進行末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP 缺口末端標記（TUNEL）染色，切片常規脫蠟至脫水，滴加20 μg·mL－1不含DNase 的蛋白酶K，37℃作用30 min，用PBS 洗3 次，再在樣品上加50 μL Tunel 檢測液，37℃孵育60 min，用PBS洗3 次，DAPI 復染細胞核，用PBS 洗3 次，后用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察。

2.10 Ki67 和CD31 染色

Ki67 和CD31 染色按照試劑說明書中的方法進行操作。切片常規脫蠟至脫水，加一抗，37℃孵育60 min，加二抗，蓋上孵育盒蓋子，37℃孵育20 min，PBS 洗3 次，加DAB 顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間（有陽性終止顯色，深棕色的細胞被視為陽性，而未染色和弱染色的細胞被視為陰性），蒸餾水沖洗，蘇木素染色1 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數秒，水洗，碳酸鋰藍化1 min，水洗，最后置于顯微鏡下觀察。

3 結果與討論

3.1 PLGA-GEM 的制備

水動力試驗表明PLGA-GEM 的水動力尺寸為223.5 nm，表明PLGA-GEM 是穩定的。由于顆粒表面存在PLGA 電離的羧基，因此Zeta 電位為－25.4 mV。SEM 圖像顯示PLGA-GEM 顆粒具有光滑的形態（見圖1A）。TEM 圖像進一步顯示PLGA-GEM 顆粒為球形（見圖1B）。在PLGA-GEM 中，GEM 的載藥量和包封效率分別為9.28%和63.7%。PLGA-GEM 體外釋放曲線（見圖1C）表明，GEM 初始釋放率為5.58%，最終釋放率為7.19%。GEM 的初始爆發釋放可能是由于吸附在顆粒表面藥物的快速釋放引起，爆發釋放后，PLGA-GEM 顯示出至少60 h 持續釋放。

圖1 PLGA-GEM 形態和釋放曲線（n ＝3）Fig 1 Morphology and release curve of PLGA-GEM（n ＝3）

3.2 細胞活力

使用0.001、0.01、0.1、1、10 和100 μmol·L－1的藥物濃度對4T1 細胞進行細胞活力分析（見圖2）。結果顯示GEM 和PLGA-GEM 對4T1 的 細胞毒性具有濃度依賴性，且GEM（IC50＝0.1537 μmol·L－1）比PLGA-GEM（IC50＝29.44 μmol·L－1）產生更高的細胞殺傷作用，可能是因為GEM 需要從納米顆粒PLGA-GEM 中緩慢釋放。

圖2 4T1 細胞活力測定結果（n ＝3，**P ＜0.01，***P ＜0.001）Fig 2 Viability of 4T1 cells（n ＝3，**P ＜0.01，***P ＜0.001）

3.3 體內抗腫瘤作用

TRS 處理一周后通過尾靜脈注射藥物治療小鼠（見圖3A），根據腫瘤大小評估TRS 后PLGAGEM 的作用。Untreated 組的腫瘤快速生長，而其他治療組的腫瘤生長則受到不同程度的抑制，其中TRS ＋PLGA-GEM 組的腫瘤體積[（523±71）mm3]最小（見圖3B）。在整個研究過程中，各組間體重均未見明顯差異（見圖3C）。在治療期結束時，TRS ＋PLGA-GEM 組的平均腫瘤質量（0.495 g）最低（P＜0.05，P＜0.001），腫瘤形態學圖也表明TRS ＋PLGA-GEM 組的腫瘤最小（見圖3D、E）。說明TRS 與PLGA-GEM 結合顯示出較好的抗腫瘤效果。

圖3 TRS ＋PLGA-GEM 對乳腺腫瘤生長的影響（n ＝5，*P ＜0.05，***P ＜0.001）Fig 3 Effect of TRS ＋PLGA-GEM on the growth of breast tumours（n ＝5，*P ＜0.05，***P ＜0.001）

3.4 TRS ＋GEM-PLGA 對4T1 細胞凋亡的影響

與其他治療組相比，TRS ＋PLGA-GEM 組的凋亡細胞數最多，凋亡率顯著高于其他組（P＜0.01，P＜0.001），結果見圖4。表明TRS 與PLGA-GEM結合可以促進小鼠乳腺癌細胞凋亡。

圖4 TRS ＋GEM-PLGA 對4T1 細胞凋亡的影響（比例尺50 μm，n ＝5，**P ＜0.01，***P ＜0.001）Fig 4 Effect of TRS ＋GEM-PLGA on the apoptosis of 4T1 cells（scale bar 50 μm，n ＝5，**P ＜0.01，***P ＜0.001）

3.5 TRS ＋GEM-PLGA 對4T1 細胞中Ki67 和CD31增殖和表達的影響

TRS ＋GEM-PLGA 組的Ki67染色細胞數最低，表明TRS 聯合PLGA-GEM 可以抑制小鼠4T1 細胞的增殖。進一步使用免疫組織化學的方法分析腫瘤生長抑制是否與血管生成有關，發現TRS ＋GEM-PLGA 組中CD31 陽性細胞的數量顯著低于其他治療組，CD31 染色結果的定量分析顯示，Unterated 組的腫瘤具有最高的微血管密度，顯著高于其余各組，表明TRS 聯合PLGA-GEM可以增強乳腺腫瘤的抗血管生成作用，見圖5。

圖5 Ki67陽性細胞（A 和B）及CD31陽性細胞（C 和D）的免疫組化及定量分析結果（比例尺50 μm，n ＝5，**P ＜0.01，***P ＜0.001）Fig 5 Immunohistochemistry and quantitative analysis Ki67-positive cells（A and B）and CD31-positive cells（C and D）（scale bar 50 μm，n ＝5，**P ＜0.01，***P ＜0.001）

3.6 TRS ＋GEM-PLGA 對腫瘤肺轉移的影響

乳腺癌術后常見的轉移是肺轉移[21]，其中灰白色，結節狀顆粒被視為轉移性結節。肉眼觀察到所有組的小鼠肺部都產生轉移性結節。TRS＋PLGA-GEM 組中的肺結節數量最低，只有少量轉移灶（中位值為11），而Unterated 組的肺結節則極為突出（中位值為31）（見圖6A）。使用HE 染色分析小鼠肺部（見圖6B），進一步驗證TRS ＋PLGA-GEM 對乳腺癌肺轉移的抑制作用。基于單個視野中的腫瘤結節數（見圖6C），計算出肺結節的腫瘤面積（見圖6D）。TRS ＋PLGA-GEM 組的肺結節腫瘤面積小于其余各組，結果表明TRS 聯合PLGA-GEM 可抑制4T1 小鼠的肺轉移。

圖6 TRS ＋PLGA-GEM 對4T1 腫瘤轉移的影響（10×，n ＝5，**P ＜0.01，***P ＜0.001）Fig 6 Effect of TRS ＋PLGA-GEM on the metastasis of 4T1-derived tumours（10×，n ＝5，**P ＜0.01，***P ＜0.001）

3.7 體內生物安全性評估

通過HE 染色檢查其他組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟）（見圖7），發現TRS 組、TRS ＋GEM 組和TRS ＋PLGA-GEM 組的器官形態均與Unterated組無明顯差異，說明TRS 結合PLGA-GEM 治療具有相對較高的安全性。

圖7 器官的組織化學染色圖像（n ＝5，比例尺50 μm）Fig 7 Histochemical staining images of organs（n ＝5，scale bar 50 μm）

4 結論

在手術和GEM 治療后，乳腺癌復發和肺轉移的風險依舊較高。納米制劑可增強GEM 的功效和減少其不良反應。筆者使用雙乳化溶劑揮發法制備PLGA-GEM，其粒徑為223.5 nm，Zetu電位為－25.4 mV。體外釋放動力學表明，封裝的GEM 藥物具有緩慢釋放的作用，可引起IC50的變化。建立不完全切除的乳腺癌手術模型，以進一步研究PLGA-GEM 對乳腺癌復發和肺轉移的影響。我們發現與GEM 相比，PLGA-GEM 可以提高乳腺癌的治療效果，包括抑制術后腫瘤的復發和肺轉移，且具有相對較高的安全性，提示GEM 納米制劑在乳腺癌的治療中可能具有較好的應用前景。