布地奈德脂質體制備工藝優(yōu)選及質量評價

馬瑞麗，楊東亮，趙宇郁，周婧，馬桂芝*（.新疆醫(yī)科大學 藥學院，烏魯木齊 8300；.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是結腸的一種慢性免疫介導的炎癥性疾病。在全球范圍內，UC 的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。糖皮質激素是活動期UC 患者誘導治療的重要藥物[2-3]，對5-氨基水楊酸應答不佳的輕、中度UC，常需全身給予糖皮質激素治療，但全身激素用藥易導致諸多藥物不良反應，如感染、庫欣綜合征、骨質疏松癥等[4]。布地奈德（budesonide）是一種合成的第二代皮質類固醇類激素，在局部給藥部位具有很強的抗炎作用，較其他皮質類固醇全身毒性小、不良反應少[5-7]，可抑制細胞免疫，減少炎性細胞浸潤，穩(wěn)定溶酶體膜，減低毛細血管通透性[8]，可有效誘導部分輕中度UC 患者的癥狀緩解[9]。

目前，臨床上多采用吸入用布地奈德混懸劑灌腸[10]，然而普通混懸液幾乎沒有生物黏附性，在直腸的自身蠕動作用下，在腸道保留時間短，局部吸收差，且布地奈德幾乎不溶于水，限制了藥物的局部吸收效果，影響藥物療效。脂質體特殊的磷脂雙分子層的膜結構可提高疏水性藥物的分散度，增加藥物溶解度，從而有可能增加布地奈德在直腸的局部吸收和局部藥物濃度[11]，并且有報道稱脂質體直接局部給藥能提高局部治療效果，降低全身給藥的不良反應[12]。故本研究優(yōu)選布地奈德脂質體的制備工藝，為后期該藥直腸定向給藥系統(tǒng)的研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；New Classic MS 分析天平（梅特勒-托利多公司，d ＝0.01 mg）；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測定儀（英國馬爾文儀器有限公司）；PS-1000 磁力攪拌器（東京理化器械株式會社）；3-18KS 臺式高速冷凍離心機（SIGMA 公司）；VCX500 超聲波細胞破碎儀（Sonics&Materials Inc）；Milli-Q 艾柯超純水儀（美國密理博公司）；JEM-1230 透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 試藥

布地奈德對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y13J7C9082，純度≥98%）；布地奈德原料藥（山東泰華生物科技有限公司，批號：20190906，純度≥99%）；大豆磷脂（批號：SYSO-200401）、膽固醇（批號：B80859）（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 脂質體中布地奈德含量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-水（72∶28）為流動相等度洗脫，檢測波長260 nm，流速1 mL·min－1，柱溫25℃；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取布地奈德對照品適量，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成196.4 μg·mL－1的對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取布地奈德脂質體1.0 mL 于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分震蕩，搖勻，于4℃、15 000 r·min－1離心15 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液適量，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 制備不含布地奈德的空白脂質體，同“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.1.5 專屬性考察 取布地奈德對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液和空白溶劑甲醇各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖1。在陰性樣品溶液的色譜圖中對照品出峰位置無色譜峰，提示基質對布地奈德的測定無干擾。理論板數按布地奈德計大于8000。

圖1 布地奈德脂質體的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of budesonide liposomes

2.1.6 線性關系考察 精密移取對照品儲備液適量，依次稀釋，制成0.38、0.77、1.53、3.07、6.14、12.28、24.55、49.1、98.2 μg·mL－1的系列對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以峰面積（y）為縱坐標，布地奈德的質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程y＝1.59×104x＋1.993×103（r＝0.9999）。結果表明，布地奈德在0.38 ～98.2 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 取同一批布地奈德脂質體，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件進樣，連續(xù)測定6 次，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為0.66%，說明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批布地奈德脂質體，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在常溫下分別于0、2、4、6、8、12 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為0.82%，表明樣品溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復性試驗 同一批布地奈德脂質體，按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品濃度。結果樣品的平均質量濃度為189.8 μg·mL－1，RSD為1.3%，表明本方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收試驗 精密量取同一批已知質量濃度的布地奈德脂質體1.0 mL，共9 份，分別置于10 mL 量瓶中，加入不同體積的“2.1.2”項下的對照品儲備液，按“2.1.3”項下方法制成低、中、高3 種質量濃度的供試品溶液各3 份，并按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD。結果低、中、高質量濃度的平均加樣回收率在97.7%～100.2%，RSD均＜2%，表明本法準確度良好。

2.1.11 耐用性試驗 取同一批布地奈德脂質體，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，參照“2.1.1”項下色譜條件進樣，考察不同色譜柱（Agilent SB-C18，SN：USCL074978、Agilent SB-C18，SN：USCL082052、Kromasil C18）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min－1）、不同柱溫（20、25、30℃）對測定結果的影響，記錄峰面積并計算樣品含量，結果不同色譜柱的峰面積RSD為3.1%，不同流速的峰面積RSD為2.7%，不同柱溫的峰面積RSD為0.74%，表明該方法耐用性良好。

2.2 脂質體工藝優(yōu)選指標——綜合評分的計算

2.2.1 權重系數的設定與綜合評分的計算 采用層次分析法[13]進行綜合評分，以包封率、載藥量和粒徑作為考察指標，引入九分位的相對重要性比例標度，評估主體確定各指標的相對重要性，賦予各指標不同的分數，比較同一層次目標的相對重要性，并構成兩兩比較矩陣，見表1。得到包封率、載藥量和粒徑的歸一化權重系數分別為0.7306、0.1884、0.0810。對其進行一致性檢驗，結果CR＝CI/RI＝0.0567 ＜0.1，表明權重系數合理。

表1 指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣Tab 1 Judgment priority matrix for pairwise comparison of indicators

結合層次分析法確定的權重系數，得到綜合評分Y＝包封率/包封率最大值×0.7306 ＋載藥量/載藥量最大值×0.1884 ＋粒徑最小值/粒徑×0.0810。

2.2.2 包封率和載藥量的測定[14-15]采用低溫超速離心法測定布地奈德脂質體的包封率和載藥量。精密量取布地奈德脂質體500 μL 于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇（接近刻度）超聲15 min，破乳后用甲醇定容，混勻后過0.22 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液20 μL 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算布地奈德總量（C總）；取布地奈德脂質體適量于離心管中，低溫（4℃）高速（18 000 r·min－1）離心60 min，取上清液500 μL 定容于10 mL 量瓶中，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液20 μL按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算游離的布地奈德（C游），按以下公式計算包封率和載藥量：包封率＝（C總－C游）/C總×100%，載藥量＝（W總－W游）/稱樣量×100%。

2.2.3 粒徑的測定 取布地奈德脂質體乳液，用超純水稀釋10 倍后取適量于測定樣品池中，通過馬爾文納米激光粒徑測定儀對脂質體的粒徑進行測定，每個樣品平行測定3 次。

2.3 乙醚注入法的工藝優(yōu)選

2.3.1 制備流程 精密稱取布地奈德原料藥、膽固醇、大豆磷脂適量于西林瓶中，加入5 mL 乙醚超聲使其溶解。將乙醚溶液用注射器緩慢勻速注入到恒溫的20 mL 超純水中，邊注入邊磁力攪拌，另取2 mL 乙醚潤洗西林瓶和注射器，同法注入到超純水中，恒溫攪拌1 h，使乙醚揮發(fā)盡后，超聲分散，即得。

2.3.2 試驗設計 根據預試驗發(fā)現，超聲分散時間、水合介質種類和攪拌速度對指標的影響較小，故確定以上三因素為固定因素，即超聲分散15 min，水合介質為超純水，攪拌速度為500 r·min－1。而膜材比（A）、脂藥比（B）和水合介質溫度（C）對指標影響較大，采用星點設計-效應面法優(yōu)化該三因素組合，優(yōu)選乙醚注入法制備布地奈德脂質體的工藝參數。試驗因素水平見表2，結果見表3。

表2 星點設計-效應面法的因素水平表Tab 2 Factor and level of central composite design-response surface method

2.3.3 數據處理 采用Design-Expert 10.0.7 軟件對表3數據進行擬合，得到綜合評分Y的回歸方程為Y＝0.8239－0.0184A－0.034B＋0.0112C＋0.0163AB＋0.0388AC－0.0315BC＋6.6697A2＋0.0178B2－3.3872C2。方差分析見表4。固定其中一個因素，繪制其他兩個因素對綜合評分的三維曲面圖，結果見圖2。

表3 星點設計-效應面法的結果Tab 3 Central composite design-response surface method

由表4可知，模型極顯著（P＜0.0001），模型的R2＝0.9680，調整R2＝0.9393，說明此模型可以解釋96.8%響應值的變化，表明模型能較好地反映膜材比（A）、脂藥比（B）和水合介質溫度（C）與綜合評分（Y）之間的變化關系。失擬項P＞0.05，不顯著，可認為無失擬因素存在。3 個因素中，A、B和C都為極顯著項（P＜0.01）；兩兩交互項中，AC、BC和BC之間交互作用極顯著（P＜0.01）。

表4 方差分析Tab 4 Analysis of variance

應用Design-Expert 10.0.7 軟件對優(yōu)選的制備工藝條件（即A＝12，B＝6，C＝60）進行預測，綜合評分的預測值為0.926。

2.3.4 驗證試驗 結合實際操作條件，初步確定優(yōu)選工藝參數為：膜材比12∶1，脂藥比6∶1，水合介質溫度60℃。按照優(yōu)選參數，采用乙醚注入法制備3 批布地奈德脂質體。結果3 批布地奈德脂質體平均包封率為75.63%，載藥量為9.17%，粒徑為276 nm，包封率、載藥量和粒徑的綜合評分與預測值相比相對誤差均小于3%，說明工藝穩(wěn)定，重現性好，結果見表5。

圖2 布地奈德脂質體制備工藝優(yōu)化的效應面圖Fig 2 Response surface for optimization of preparation process of budesonide liposomes

表5 驗證試驗結果(n ＝3)Tab 5 Verification test (n ＝3)

2.4 薄膜分散法的工藝優(yōu)選

2.4.1 工藝流程 精密稱取布地奈德原料藥、膽固醇、大豆磷脂適量于250 mL 的圓底燒瓶中，加入10 mL 氯仿超聲使其溶解。置于旋轉蒸發(fā)儀，在真空恒溫水浴條件下，旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，使得脂質材料在圓底燒瓶內壁形成一層透明狀的均勻薄膜，增大真空度除去殘留有機溶劑。加入超純水20 mL，搖晃至均勻混合，恒溫水浴下常壓旋轉水合30 min，冰浴條件下探頭超聲（超2 s，停3 s），即得。

2.4.2 試驗設計 在預試驗中采用單因素試驗考察了膜材比、脂藥比、有機溶劑種類、水合介質種類、旋蒸溫度、超聲功率和超聲時間7 個因素對指標的影響，結果表明膜材比、有機溶劑種類、水合介質種類、旋蒸溫度和超聲功率對指標的影響較小，可作為固定因素，其因素水平固定為膜材比12∶1、有機溶劑為氯仿、水合介質為超純水、旋蒸溫度為20℃，超聲功率為30%。脂藥比（A）和超聲時間（B）對指標影響較大，采用星點設計-效應面法優(yōu)選薄膜分散法的最佳制備工藝。結果薄膜分散法最佳工藝制備的脂質體平均包封率為67.09%，平均載藥量為7.56%，平均粒徑為279.87 nm。

2.5 制備方法的確定

通過對乙醚注入法和薄膜分散法的數據進行比較，發(fā)現乙醚注入法制備的布地奈德脂質體的包封率、載藥量和綜合評分都相對較高，故最終確定乙醚注入法為布地奈德脂質體的制備方法。

2.6 最優(yōu)處方布地奈德脂質體的質量評價

2.6.1 形態(tài)觀察 在室溫條件下，取適量最優(yōu)處方制備的布地奈德脂質體原液，滴于銅網上靜置5 min 后，用濾紙吸掉多余混懸液，用2%磷鎢酸負染30 s 后晾干，置于透射電鏡下觀察并拍照，如圖3所示。透射電鏡結果顯示，脂質體粒子小而均勻，呈球形，且粒子大小與粒徑測定結果基本吻合。

圖3 不同倍數及標尺下布地奈德脂質體的透射電鏡圖Fig 3 Transmission electron micrograph of budesonide liposomes at different multiples and scales

2.6.2 包封率和載藥量的測定 按“2.2.2”項下方法測定布地奈德脂質體的包封率和載藥量，結果其包封率為（75.63±1.1）%，載藥量為（9.17±0.4）%。

2.6.3 粒徑、分散指數和電位的測定 按“2.2.3”項下方法測得布地奈德脂質體的平均粒徑為（276±32.9）nm，PDI 為（0.35±0.1），平均Zeta電位為－（44.87±5）mV。布地奈德脂質體的粒徑和Zeta 電位分布見圖4。

圖4 布地奈德脂質體的粒徑（A）和Zeta 電位分布（B）Fig 4 Particle size（A）and Zeta potential distribution（B）of budesonide liposomes

3 討論

布地奈德一般采用高效液相法進行含量測定[16]，本文采用二極管陣列檢測器對對照品溶液進行全波長掃描發(fā)現，布地奈德在244 nm 波長處有最大吸收，但在該波長處，溶劑甲醇會對樣品的測定產生干擾。通過改變色譜條件、流動相比例、柱溫等依然無法排除溶劑的干擾，故最終選擇溶劑在布地奈德出峰的位置沒有干擾的260 nm 作為含量測定的檢測波長。

在預試驗中曾以包封率、載藥量、粒徑、PDI和電位5 個指標作為評價制備工藝的參數，但單因素試驗結果表明，各考察因素的水平值的改變對PDI 和電位并無顯著影響，故最終只選擇包封率、載藥量和粒徑3 個指標。為保證評價結果的科學性和合理性，本試驗采用層次分析法對多指標進行賦權，以加權后綜合評分為因變量，不僅能全面地反映各檢測指標對脂質體的重要程度，也能直觀地反映整體制備工藝。

薄膜分散法和溶劑注入法是制備脂質體時較常用的兩種方法。本試驗采用薄膜分散法制備布地奈德脂質體時發(fā)現，脂質體粒徑太大。通過物理方法探頭超聲或者過膜之后，粒徑都有所減小，但脂質體的包封率會明顯降低，這可能與薄膜分散法制備的脂質體粒徑本身比較大有關（有文獻報道薄膜分散法制備的脂質體粒徑一般在1 ～5 μm[17]），而物理方法處理時對脂質體膜壁會造成一定的破壞，導致包封率顯著降低。而乙醚注入法制備的脂質體本身粒徑就比較小，一般在50 ～200 nm[17]，無需再通過物理方法來減小粒徑，因此包封率較高。

綜上所述，本文建立的測定布地奈德脂質體含量的高效液相檢測方法準確可靠、專屬性強，優(yōu)選的制備工藝簡單穩(wěn)定，重現性好，可用于布地奈德脂質體的制備。