白花蛇舌草內(nèi)生真菌的分離與鑒定

趙作威，葉穎曉，劉明爽，文春南，王旭光，劉淼*，麻兵繼，*（.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材系，鄭州 450046；.河南白云牧港生物科技有限公司，河南 登封 45400）

白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld.）是茜草科耳草屬植物[1]，全草入藥，具有清熱解毒、利濕通淋等功效[2]。在我國(guó)安徽、云南以及兩廣地區(qū)均有分布[3]。白花蛇舌草在中醫(yī)臨床上常與其他藥物配合使用以治療各種癌癥以及各種炎癥，尤其在治療惡性腫瘤方面是最常用的中藥材之一[4-5]。因此，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)白花蛇舌草的需求量劇增，導(dǎo)致野生資源逐漸減少[6]。為了滿足市場(chǎng)需求，現(xiàn)多進(jìn)行人工栽培。目前，白花蛇舌草在河南省確山縣人工栽培規(guī)模較大，年產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的一半，現(xiàn)已成為河南大宗藥材之一[7]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)白花蛇舌草開展了大量研究，主要聚焦于栽培技術(shù)[8]、化學(xué)成分[9-10]、提取工藝[11]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[12-13]和藥理作用[14-15]等方面。而對(duì)其內(nèi)生真菌的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。植物內(nèi)生真菌是結(jié)構(gòu)豐富多樣、生物活性廣泛的次生代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源，在藥物研發(fā)、植物病害防治等方面具有重要作用[16]。此外，有些藥用植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的活性物質(zhì)，能夠促進(jìn)寄主植物次生代謝產(chǎn)物的形成和積累，提高活性成分的產(chǎn)量[17-19]。本研究對(duì)采自河南確山縣的白花蛇舌草進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和鑒定，探究其內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步挖掘白花蛇舌草內(nèi)生真菌及其活性次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

健康無(wú)病害的白花蛇舌草植株于2018年10月采自河南省確山縣基地，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)李賀敏副教授鑒定為Hedyotis diffusaWilld.。LDZF-50kB 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)（名牌之星）；QHZ-98A 全溫震蕩搖床（太倉(cāng)市華美生化儀器廠）；GXZ 型（多段編程）智能光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；H1650-W 臺(tái)式微量離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；PCR 儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；電泳儀（JY300C通用型電源，JY-SPCT 型水平電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；2500R 型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）；真菌通用引物ITS1 和ITS4（華大基因）；真菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA Marker、Premix Taq、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar Medium，PDA）（北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化

剪取健康的白花蛇舌草植株，用無(wú)菌水將表面沖洗干凈，放入超凈工作臺(tái)中紫外線消毒15 min，然后依次用75%乙醇（30 s）、3% NaClO 溶液（60 s）、75%乙醇（30 s）進(jìn)行表面滅菌。用無(wú)菌水沖洗后，用已滅菌處理的手術(shù)刀將白花蛇舌草的根、莖和葉切成小塊組織，接種到滅菌后的PDA 培養(yǎng)基上，每塊PDA 培養(yǎng)基上，呈“品”字形放置三塊植物組織，重復(fù)兩組實(shí)驗(yàn)。然后將已接種的PDA平板置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃的條件下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基上觀察到明顯的菌絲時(shí)，用接種針將形態(tài)不同的真菌分別挑出，接種到新的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種純化，重復(fù)實(shí)驗(yàn)直至得到單一菌株。

2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

2.2.1 內(nèi)生真菌基因組DNA 的提取 將分離純化所得內(nèi)生真菌，接種于PDA 培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃條件下培養(yǎng)5 d。取適量菌絲，參照真菌基因組DNA 提取試劑盒方法提取白花蛇舌草內(nèi)生真菌的基因組。

加入20 μL 的RNase A 和100 mg 玻璃珠，用研磨儀研磨5 min。加入20 μL 蛋白酶K（10 mg·mL－1），混勻后置于55 ℃水浴鍋中消化30 min，12 000 r·min－1離心3 ～4 min，吸取上清液，加入200 μL 溶液B 充分混勻。若出現(xiàn)白色沉淀，置于55℃水浴至溶液清亮。加入200 μL無(wú)水乙醇混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱，放置2～5 min，12 000 r·min－1離心1 min。向吸附柱加入600 μL 稀釋過(guò)的漂洗液，12 000 r·min－1離心2 ～3 min，棄去下層廢液。然后將吸附柱放到收集管，離心2 min，取出吸附柱，低溫烘干（45℃）或室溫自然揮干吸附柱中的漂洗液。將吸附柱放入離心管中，滴加125 μL 洗脫液（65℃水浴保溫），放置5 ～6 min，12 000 r·min－1離心1 ～2 min，將離心管中的洗脫液再次轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置2 min，12 000 r·min－1離心2 min，即得內(nèi)生真菌DNA。

2.2.2 內(nèi)生真菌ITS 區(qū)的PCR 擴(kuò)增與內(nèi)生真菌的鑒定 用PCR 儀對(duì)內(nèi)生真菌DNA 進(jìn)行5.8S rDNA-ITS 區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為通用ITS 引物：ITS1 5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'，ITS4 5'TCCTCCGCTTATTGAATGC3'。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序按照本研究組前期發(fā)表文獻(xiàn)方法進(jìn)行[20-21]。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，1×TAE 電泳液，電壓為5 V·cm－1，以2000 bp的DNA Marker 作為對(duì)照，電泳時(shí)間為22 min。完成電泳后，用EB 溶液對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行染色，然后放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，選擇在550 bp 附近有明亮、單一基因條帶的樣品測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。

3 結(jié)果

3.1 白花蛇舌草內(nèi)生真菌的鑒定

將測(cè)序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)真菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，共從白花蛇舌草植株中分離得到11 株內(nèi)生真菌，分屬于4 個(gè)不同的屬，其中鐮刀菌屬4 株（Y-1、Y-2、Y-4、Y-9），白杯絲座孢屬5 株（Y-3、Y-6、Y-7、Y-8、Y-10），尾孢屬1 株（Y-5），鏈格孢屬1 株（Y-11）（見(jiàn)表1）。以鐮刀菌屬和白杯絲座孢屬真菌為主。從菌株來(lái)源部位來(lái)看，從莖中共分離得到8 株真菌，從葉中得到2 株真菌。從根部?jī)H得到1 株鏈格孢屬真菌，且在莖和葉中均未發(fā)現(xiàn)。由此說(shuō)明，白花蛇舌草莖中真菌種類相對(duì)于葉和根更加豐富。

表1 白花蛇舌草內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果Tab 1 Identification results of the endophytic fungi from Hedyotis diffusa

3.2 白花蛇舌草內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將得到的菌株用MEGA 7.0 軟件，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見(jiàn)圖1）。通過(guò)分析系統(tǒng)發(fā)育樹可以發(fā)現(xiàn)，尾孢屬和鏈格孢屬同源支持率達(dá)到了100%。基于5.8S-ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，供試菌株Y-3/6/7/8/10 與白杯絲座孢屬中的Xepicula leucotricha聚在同一個(gè)分支上，其節(jié)點(diǎn)支持率達(dá)到100%，供試菌株Y-1/2/4/9 與鐮刀菌屬的菌株聚集在兩個(gè)分支上，其中Y-9 與Fusarium proliferatum處于同一分支上，節(jié)點(diǎn)支持率為100%，Y-1/2/4 與鐮刀菌屬中Fusarium chlamydosporum、Fusarium equiseti聚集在同一個(gè)分支上，遺傳距離較近，節(jié)點(diǎn)支持率為100%。根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)分析表明，鐮刀菌屬的4 株供試菌株間的差異性較大，而白杯絲座孢屬的5 株供試菌株種間差異較小。

圖1 以最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 1 Phylogenetic tree constructed by Maximum Likelihood method

4 結(jié)論與討論

本研究首次對(duì)白花蛇舌草的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離與鑒定，共從白花蛇舌草植株中分離得到11株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為分屬于4 個(gè)不同的屬，其中以鐮刀菌屬和白杯絲座孢屬為主，分離得到的內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)較為單一。考慮到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分離菌種僅采用了PDA 培養(yǎng)基，可能會(huì)造成一些可培養(yǎng)真菌未能成功培養(yǎng)。因此，本課題組于2019年7月再次采集了該產(chǎn)地人工栽培的白花蛇舌草樣品，分別采用麥芽浸膏培養(yǎng)基（Malt Extract Agar Medium，MEA）、孟加拉紅培養(yǎng)基（Rose Bengal Agar Medium，RBA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek Dox Agar Medium，CDA）和高氏一號(hào)培養(yǎng)基（GAUZE's Medium NO.1，GSA）對(duì)其內(nèi)生真菌進(jìn)行了二次分離。結(jié)果僅分離得到6 株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定仍隸屬于鐮刀菌屬（2 株）、白杯絲座孢屬（2 株）、鏈格孢屬（1 株）和尾孢屬（1 株）4 個(gè)不同的屬。以上結(jié)果表明，該地區(qū)人工栽培白花蛇舌草中可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌種類較為單一。

盡管本研究后期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了重復(fù)，但得到的真菌菌群結(jié)構(gòu)仍相對(duì)單一。分析其可能的原因如下：

其一，白花蛇舌草植株較小，在進(jìn)行表面滅菌時(shí)，滅菌不徹底會(huì)造成外源真菌混入，而嚴(yán)格的表面滅菌又可能殺死一些內(nèi)生真菌，最終導(dǎo)致真菌種類較少。因此，針對(duì)不同的植物樣本，應(yīng)探索與之適應(yīng)的表面滅菌方法。

其二，植物中存在一些對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有特殊需求的內(nèi)生真菌，在進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離時(shí)采用的培養(yǎng)基種類較少的情況下，有些內(nèi)生真菌無(wú)法培養(yǎng)得到。而有些內(nèi)生真菌本身生長(zhǎng)緩慢，在分離時(shí)易被忽視。此外，植物中還可能有一些不可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌。在實(shí)驗(yàn)中，為了盡可能多地獲取植物內(nèi)生真菌，需要采用種類更多、營(yíng)養(yǎng)更全面的培養(yǎng)基。

其三，不同生長(zhǎng)環(huán)境、不同發(fā)育階段、不同組織部位的植物樣品中內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)也會(huì)存在差異，因此，為了充分挖掘植物內(nèi)生真菌資源，還應(yīng)該在不同生長(zhǎng)環(huán)境、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，取植物不同的組織部位分離其內(nèi)生真菌。

最后，有些植物內(nèi)生真菌自身種群結(jié)構(gòu)本不豐富，因此分離得到的菌種較為單一。近年來(lái)，隨著白花蛇舌草需求量的增加以及野生資源的逐漸減少，人工栽培成為解決其資源問(wèn)題的重要途徑。河南省確山縣人工栽培白花蛇舌草規(guī)模大、產(chǎn)量高，已成為河南省大宗藥材之一。藥用植物內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)藥用植物生長(zhǎng)、對(duì)抗環(huán)境脅迫、藥效物質(zhì)積累等，在多個(gè)方面對(duì)藥用植物的品質(zhì)形成具有重要的生態(tài)效應(yīng)。因此，白花蛇舌草植株體內(nèi)的內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)與其藥材品質(zhì)之間的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。總之，本研究首次對(duì)河南確山縣人工栽培白花蛇舌草的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離鑒定，初步探討了其內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)，為后續(xù)探討白花蛇舌草內(nèi)生真菌與藥材品質(zhì)相關(guān)性，以及挖掘內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物等研究奠定了基礎(chǔ)。