圓支清疫苗中豬圓環病毒2型對豬肺炎支原體的免疫增強作用

車巧林， 董彥鵬，劉茂軍，耿曉眉，繆芬芳

(1. 江蘇南農高科技股份有限公司，江蘇 江陰 214400；2. 江蘇省農科院獸醫研究所，江蘇 南京 210014)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo)是引起豬支原體肺炎的主要病原，在豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)發生過程中起著重要作用。20世紀90年代后期，北美和歐洲出現了豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)[1-2]。PCV2感染后除引起仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)外，還引起豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、母豬繁殖障礙、新生仔豬先天性震顫(CT)、增生性壞死性肺炎(PNP)和腸炎等[3-4]。單獨Mhyo或PCV2感染并不足以引起疾病的臨床表現，但是并發或繼發其他細菌或病毒感染時，可使死亡率大大提高。

Mhyo與PCV2之間存在協同感染，Mhyo可以增強PCV2相關性肺損傷的嚴重性，增加PCV2在組織中的數量和分布[5]。對4周齡的斷奶仔豬進行Mhyo攻毒，6周齡時再用PCV2攻毒，結果豬表現出嚴重的呼吸道疾病，血清中PCV2 的拷貝數顯著上升, 病毒血癥持續期延長，肺組織和淋巴組織的病理損傷比單獨Mhyo或PCV2感染時嚴重[6]。

迄今為止，對病原之間共感染的研究比較多，但是對聯苗各抗原之間的相互作用研究甚少。本研究用3組相同Mhyo抗原含量、不同PCV2抗原含量的圓支二聯疫苗和1組相同Mhyo抗原含量的單苗分別免疫BALB/c小鼠、新西蘭大耳白兔和健康仔豬，測定血清中PCV2抗體和Mhyo抗體，并在仔豬二免后進行Mhyo強毒攻擊，觀察肺部病變程度，闡明PCV2與Mhyo抗原之間的免疫協同關系。

1 材料與方法

1.1 菌株、毒株和細胞

Mhyo HN0613株(代次F6)和PCV2 SH株，PK15-B1克隆細胞，均由江蘇南農高科技股份有限公司鑒定并保存。

1.2 主要試劑

MEM干粉培養基購自Gibco Invitrogen公司；Friis培養基由江蘇南農高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氫溴酸鹽(BEA),購自 Sigma Aldrich 公司；無水硫代硫酸鈉購自Alfa Aesar 公司；β-丙內酯購自Serva公司；豬支原體肺炎ELISA抗體檢測試劑盒購自 IDEXX 公司；PCV2抗體檢測試劑盒購自BioChck公司；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒購自生工公司；Mhyo微量間接血凝(IHA)檢測試劑盒由江蘇南農高科技股份有限公司自制。

1.3 試驗動物

16～18 g健康雌性BALB/c小鼠，PCV2 ELISA抗體陰性(效價<1∶50)；1～1.5 kg新西蘭大耳白兔，Mhyo IHA抗體陰性(效價<1∶5)；21日齡健康仔豬，PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原陰性，PCV2、Mhyo ELISA母源抗體陰性。

1.4 Mhyo菌液的制備及滅活

Mhyo HN0613株F6代凍干菌種用2 mL Friis培養基溶解，以10%比例接種于含20 mL Friis培養基的100 mL鹽水瓶中，37 ℃恒溫培養箱中靜置培養至pH=6.7～6.8時收獲。收獲的菌液以5%比例接種于含400 mL Friis培養基的三角瓶中，120 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養，待pH值下降到6.7～6.8時收獲。收獲菌液測定顏色變化單位(CCU)。

向Mhyo菌液中加入過濾除菌的0.1 mol/L的BEI溶液，使終濃度為4 mmol/L，37℃恒溫振蕩24 h后加入終濃度為10 mmol/L的硫代硫酸鈉溶液，37 ℃恒溫振蕩1 h終止滅活。取1 mL滅活菌液接種50 mL Friis液體培養基進行滅活檢驗，37 ℃培養5 d后再取0.5 mL培養物移植到4.5 mL Friis液體培養基，37 ℃繼續培養觀察10 d。

1.5 PCV2病毒液的制備及滅活

從細胞庫中取出凍存的PK15-B1克隆細胞復蘇，加入含10%新生牛血清的MEM培養液，置37 ℃、含5% CO2培養箱中培養24～48 h。當其長成良好單層時，棄去培養液，加入EDTA-胰酶細胞分散液消化，按1∶2～1∶3比例傳代增殖培養。將擴大培養的細胞接種到細胞轉瓶中，轉速為10～12 r/h，置36～37 ℃培養24～48 h。當轉瓶細胞形成良好單層時，按1∶2～1∶3比例傳代繼續擴大培養1次，待轉瓶細胞形成良好單層時，按5%接種PCV2 SH毒種，置37 ℃下吸附30 min，加入細胞維持液，置37 ℃下旋轉培養，轉速為10～12 r/h，每日觀察1～2次，細胞應生長良好，37 ℃下培養4 d，置-20 ℃下反復凍融2～3次，收獲細胞培養物并留樣作病毒含量測定。

向PCV2病毒液中加入終濃度0.1%的β-丙內酯，4 ℃振蕩滅活30 h，37 ℃恒溫振蕩水解2 h。取少量滅活病毒液進行滅活檢驗，即少量病毒液接種已長成單層的PK15-B1克隆細胞，置37 ℃下吸附1 h，棄去病毒液，加入新的細胞維持液，置37 ℃下繼續培養2 d，應無細胞病變(CPE)，連續盲傳3代后，用免疫熒光法(IFA)檢測。

1.6 PCV2病毒液的濃縮及Western blot檢測

PCV2滅活抗原經300 kDa的中空纖維膜超濾柱分別進行2倍和3倍濃縮。濃縮后的抗原進行SDS-PAGE分析。電泳結束后將未染色的凝膠、裁減好的NC膜夾于濾紙之間，按照負極-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-正極的順序放入裝有電轉液的電泳槽，200 mA恒流轉印80 min。轉印結束后，NC膜放入麗春紅染色液中染色1～2 min，PBS洗去麗春紅染液。NC膜清洗干凈后，放入5%脫脂乳PBS中4 ℃過夜封閉，TBST洗滌2次。加入1∶1 000稀釋的3E5單抗(PCV2單抗，南京農業大學動物醫學院制備)，室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，再加入1∶2 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，化學發光試劑盒顯色10 s～1 min，化學發光儀顯影0.5～20 s，拍照。

1.7 滅活疫苗的制備

未經濃縮的PCV2抗原、濃縮2倍和3倍的PCV2抗原分別與Mhyo抗原以5∶4比例混勻，低速攪拌10 min，再與Gel佐劑(Seppic公司)以9∶1的比例混合，低速攪拌20 min，NaOH溶液調節pH值至6.2～6.3，分裝，每瓶20 mL。

生理鹽水與Mhyo抗原以5∶4比例混勻，再與Gel佐劑以9∶1比例混合，低速攪拌20 min，配制1組只含Mhyo抗原的疫苗。疫苗各組分見表1，配制的疫苗進行無菌檢驗。

表1 滅活疫苗組別及各組分用量

1.8 替代動物免疫及血清抗體水平檢測

1.8.1 BALB/c小鼠免疫及血清抗體ELISA檢測

選取16～18 g PCV2 ELISA抗體陰性(效價低于1∶50)的健康雌性BALB/c小鼠25只，隨機分成5組，每組5只。第1～4組分別皮下接種豬支原體肺炎單苗，圓支二聯疫苗1、2和3，每只0.2 mL，14 d后按相同途徑和劑量進行二免；第5組不接種，作為空白對照。各組小鼠均隔離飼養、觀察。二免后21 d采血，分離血清，用自制的小鼠血清間接ELISA試劑盒測定小鼠血清中的PCV2 ELISA抗體效價。

1.8.2 家兔免疫及血清抗體IHA測定

1～1.5 kg Mhyo IHA抗體陰性(效價低于1∶5)的健康新西蘭大耳白兔25只，隨機分成5組，每組5只。第1～4組每只后腿肌肉注射豬支原體肺炎單苗，圓支二聯疫苗1、2和3，每只0.5 mL，第5組不免疫，作空白對照。免疫后28 d采血，分離血清，測定兔血清中Mhyo IHA抗體效價。

1.9 本體動物免疫、攻毒、血清抗體及PCV2抗原檢測

1.9.1 仔豬免疫及攻毒

25頭21日齡健康易感仔豬隨機分成5組，每組5頭。第1～4組分別頸部肌肉注射豬支原體肺炎單苗，圓支二聯疫苗1、2和3，每頭豬注射1頭份(2 mL)，第5組每頭注射不含抗原成分、只由培養液和佐劑配制的安慰劑2 mL，作為攻毒對照組。疫苗接種組及攻毒對照組首免后14 d加強免疫1次，免疫劑量為2 mL/頭。二免后28 d，所有試驗組豬氣管注射Mhyo濟南系強毒10 mL(含100個最小發病劑量)，連續觀察28 d，剖殺取肺。

1.9.2 仔豬血清抗體檢測

所有仔豬在首免當天接種前及首免后14 d(二免接種前)、28 d、42 d(攻毒前)、56 d、70 d(剖殺前)分別采血，分離血清，Mhyo血清抗體采用 IDEXX間接ELISA抗體檢測試劑盒和自制的微量間接血凝檢測試劑盒進行檢測，PCV2血清抗體采用BioChek 間接ELISA抗體檢測試劑盒進行檢測。

1.9.3 仔豬攻毒后肺部病變情況

Mhyo濟南系強毒攻擊后28 d剖殺所有試驗豬，按照28分法對試驗豬的肺炎病變進行評分[7]。分別對免疫組豬和對照組豬進行打分，按照以下公式計算肺部病變減少率：

1.9.4 仔豬血清及肺組織PCV2 抗原檢測

所有仔豬首免后14、28、42、56、70 d采血分離的血清，70 d剖殺時采集的肺組織按照Ezup 柱式病毒 DNA 抽提試劑盒操作步驟提取 DNA，用PCV2特異性引物進行PCR擴增。引物序列為：PCV2-F：5′-TTC GGT ACC AGC TAT GAC GTA TCC AAG-3′，PCV2-R：5′-GCC AAG CTT TCA CTT CGT AAT GGT TTT-3′。擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 Mhyo菌液的制備及滅活

收獲的Mhyo菌液CCU測定結果為109CCU/mL，經終濃度4 mmol/L BEI滅活24 h后進行滅活檢驗，2次培養物均不變色，說明滅活徹底。

2.2 PCV2病毒液的制備及滅活

收獲的PCV2病毒液含量為106.5TCID50/mL，少量滅活病毒液接種PK15-B1克隆細胞連續盲傳3代，IFA法檢測無綠色熒光著染的PCV2陽性細胞，說明病毒液滅活徹底。

2.3 PCV2病毒液的Western blot檢測

未經濃縮的PCV2滅活抗原，經中空纖維膜濃縮2倍、3倍的滅活抗原同時進行Western blot檢測，在27 kDa左右有條帶，說明有明顯的免疫反應性，并且條帶隨著濃縮倍數的增加而變粗，見圖1。

2.4 小鼠血清PCV2抗體ELISA檢測

5個試驗組的小鼠全部采血并分離血清，用自制的小鼠血清間接ELISA試劑盒測定血清中PCV2抗體效價。同稀釋度待檢血清OD450 nm值/陰性血清OD450 nm值(P/N值)不低于2.1時判為陽性，以P/N值不低于2.1的血清最大稀釋度作為該血清的ELISA抗體效價。小鼠血清中PCV2 ELISA抗體效價不高于1∶50，判為陰性；高于1∶50，判為陽性。小鼠血清PCV2 ELISA抗體效價結果見表2，由表2可以看出，豬支原體肺炎單苗組與空白對照組PCV2抗體均呈陰性，圓支二聯疫苗1、2和3免疫小鼠產生的PCV2抗體效價隨著圓環病毒含量的增加而增加。

M.預染Marker；1.濃縮3倍的PCV2抗原；2.濃縮2倍的PCV2抗原；3.不濃縮的PCV2抗原

表2 小鼠血清PCV2 ELISA抗體檢測結果

2.5 兔血清Mhyo IHA抗體效價測定

5個試驗組的兔子全部采血并分離血清，用IHA測定血清中Mhyo抗體效價。結果見表3，由表3可以看出，空白對照組Mhyo抗體為陰性，豬支原體肺炎單苗組平均效價為1∶88，相同Mhyo含量、不同PCV2含量的圓支二聯疫苗1、2和3免疫兔子產生的Mhyo抗體效價隨著PCV2含量的增加而提高，這說明PCV2全病毒可能對Mhyo的免疫有增強作用。

表3 兔血清Mhyo IHA抗體測定結果

2.6 仔豬血清抗體檢測

仔豬血清PCV2抗體檢測結果見表4，從表4可以看出圓支二聯疫苗3在首免后14 d PCV2抗體轉為陽性，在首免后56 d達到高峰，首免后70 d開始下降；圓支二聯疫苗1和圓支二聯疫苗2在首免后28 d(即二免后14 d)PCV2抗體轉為陽性，在首免后42 d 至70 d PCV2抗體處于一個穩定期；豬支原體肺炎單苗組和攻毒對照組在整個檢測期間PCV2抗體均呈陰性。綜合各組PCV2抗體水平結果，說明疫苗中PCV2抗原含量越高，豬PCV2血清抗體越早轉化成陽性，且達到的抗體水平也越高。

仔豬血清Mhyo ELISA 抗體檢測結果見表5，從表中可以看出所有免疫組在首免后28 d(即二免后14 d) Mhyo抗體轉為陽性，且抗體在持續上升，首免42 d采血結束后進行Mhyo強毒攻擊，攻毒后所有組別Mhyo抗體水平在上升，攻毒對照組在攻毒后28 d抗體轉為陽性。免疫組別中，隨著疫苗中PCV2抗原含量的增加，免疫后Myho抗體水平也在提高，說明PCV2抗原對Mhyo抗體的產生有促進作用。

表4 仔豬血清PCV2 ELISA抗體檢測結果(S/P值)

表5 仔豬血清Mhyo ELISA抗體檢測結果(S/P值)

仔豬血清Mhyo IHA檢測結果見表6，從表中可以看出IHA檢測結果與ELISA檢測結果基本一致，只有首免后28 d Mhyo抗體有所差別，豬支原體肺炎單苗組和圓支二聯疫苗1組首免后28 d(即二免后14 d)Mhyo抗體效價>1∶5，可疑；圓支二聯疫苗2組和圓支二聯疫苗3組 Mhyo抗體轉為陽性，大于1∶10。Mhyo IHA檢測結果同樣說明PCV2抗原對Myho抗體的產生有促進作用。

表6 仔豬血清Mhyo IHA抗體效價檢測結果

2.7 仔豬肺部病變情況

Mhyo濟南系強毒攻擊后，采用28分法評分，結果如下：攻毒對照組肺部病變平均得分最高，為12.8，豬支原體肺炎單苗組、圓支二聯疫苗1、2和3組肺部病變平均得分依次降低，肺部病變減少率依次升高，且圓支二聯疫苗2和圓支二聯疫苗3肺部病變減少率均在80%以上(結果見表7)。這說明圓支二聯疫苗中PCV2抗原對Mhyo免疫有增強作用，且隨著PCV2全病毒抗原含量的增加，免疫保護效果隨之增強。部分豬的病變情況見圖2。

表7 各組肺部病變評分及肺部病變減少率

A.豬支原體肺炎單苗組; B.圓支二聯疫苗1組;C.圓支二聯疫苗2組;D.圓支二聯疫苗3組;E、F.攻毒對照組，其中：箭頭指示有病變的地方

2.8 仔豬血清及肺組織PCV2抗原檢測

所有仔豬首免后14、28、42、56和70 d采血分離的血清，70 d剖殺時采集的肺組織用PCV2特異性引物進行PCR擴增，所有血清及肺組織樣品在751 bp處均沒有出現特異性條帶(部分血清及肺組織PCR結果見圖3)，這說明在仔豬的整個試驗過程中未受到野毒PCV2的感染。

M.Marker；+.陽性對照；-.陰性對照；1～5.豬支原體肺炎單苗組;6～10.圓支二聯疫苗1組;11～15.圓支二聯疫苗2組;16～20.圓支二聯疫苗3組;21～25.攻毒對照組

3 討論

在前期研究中，用Mhyo抗原含量相同、PCV2抗原含量不同的2組圓支二聯疫苗免疫新西蘭大耳白兔，結果發現圓環病毒經過中空纖維濃縮后含量高的圓支二聯疫苗組Mhyo抗體效價更高，且同樣經過中空纖維濃縮，不含圓環病毒抗原的MEM培養基與不含Mhyo抗原的Friis培養基配制的疫苗，免疫后未檢測到Mhyo抗體；Mhyo抗原含量高、圓環病毒含量低和Mhyo抗原含量低、圓環病毒含量高的2組圓支二聯疫苗免疫新西蘭大耳白兔，結果后者免疫后產生的Mhyo抗體效價反而比前者免疫后產生的抗體效價高。由這2個試驗結果猜測PCV2全病毒可能對Mhyo免疫具有促進作用，因此設計本研究進行驗證。

本研究結果進一步證實，PCV2全病毒對Mhyo的免疫具有促進作用，這可能與PCV2基因組內含有的CpG基序(CpG-寡聚脫氧核苷酸序列，簡稱CpG-ONG)有關。PCV2基因組中至少含有18個CpG基序，并且在豬外周血單核細胞培養物中能誘導IFN-α 的產生[8]。在體外條件下，利用與PCV2不相關的CpG-ONG序列也能誘導白細胞介素2(IL-2)、IL-10或γ干擾素(IFN-γ)的產生[9]。Opriessnig等[6]在研究Mhyo與PCV2之間的關系時，得到了類似的結果，即先后感染Mhyo和PCV2的豬產生的Mhyo血清ELISA抗體水平顯著高于只感染Mhyo的豬產生的ELISA抗體水平。

另外，Yim等[10]發現支氣管敗血波氏桿菌抗原對Mhyo的免疫也具有促進作用，接種支氣管敗血波氏桿菌抗原和Mhyo抗原的小鼠產生的Mhyo特異性IgG高于只接種Mhyo抗原小鼠產生的特異性IgG。Thacker等[11-12]揭示了Mhyo與PRRSV、豬流感病毒(SIV)發生共感染時可以增加Mhyo抗體水平。這些結果提示了Mhyo聯苗的免疫效果可能優于豬支原體肺炎單苗。