人工蟬花多糖對三黃雞免疫功能及部分相關因子基因表達的影響

劉素貞，李瑞萍，劉長國，盧立志,,李國勤,田勇，柴一秋，姚火春

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2.溫州科技職業學院動物科學學院，浙江 溫州 325000；3. 浙江農林大學動物科技學院，浙江 杭州 311300；4. 浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021；5. 浙江省亞熱帶作物研究所/溫州市蟲生真菌資源研究與開發重點實驗室，浙江 溫州 325005)

目前，細菌抗藥性問題給人類帶來了嚴重的威脅，為了維護動物源性食品安全和公共衛生安全，農業農村部提出加強藥物的監督管理工作，逐步停止除中草藥外的促生長類藥物飼料添加劑的使用，倡導開發新型飼料添加劑替代抗菌促生長類飼料添加劑[1-3]。

我國中藥材資源豐厚，開發新型中草藥具有廣泛的發展空間。研究表明，植物多糖具有提高機體免疫力、抗菌、抗病毒等多種作用[4-5]，因此多糖對動物機體免疫調節活性的研究成為熱點[6]。蟬花富產于浙江、四川等地，含有多種糖原、生物堿、蛋白質等成分，其中以多糖類和蛋白質為主。

蟬花具有抵抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[7]，但對雞的藥理作用尚未見報道。野生蟬花資源稀少，人工培養蟬花與野生蟬花成分相似，多糖、蟲草酸、必需氨基酸等高于野生蟬花[8]。浙江亞熱帶作物研究所通過人工培養技術獲得蟬花不同產品，其中有：蟬花菌絲體和蟬花多糖(從蟬花菌絲體中提取所得的蟬花粗多糖，蟬花菌絲體中蟬花多糖的提取得率為14.2%)，蟬花多糖的生產成本大約是蟬花菌絲體的7倍多。與野生蟬花相比，這2種產品具有價格低、更容易產業化等特點。本試驗在前期試驗基礎上，選取人工培養的蟬花中富含多糖成分的2種產品作為飼料添加劑[9]，通過研究其對生態放養三黃雞體液免疫水平、細胞因子水平及與免疫相關因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素4(IL-4)等mRNA表達變化，分析蟬花多糖、蟬花菌絲體對禽流感免疫的作用，進而為養雞業綠色生態發展、推廣應用性價比高的蟬花產品提供試驗數據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

蟬花多糖(多糖含量44.6%)、蟬花菌絲體干燥物(多糖提取得率為14.2%)， 均由浙江省亞熱帶作物研究所提供；禽流感疫苗(H5-Re8+H7N9)購自哈藥集團有限公司。

1.2 主要試劑

IL-2、IL-4、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等試劑盒(北京瑞格博科技發展有限公司)，禽流感標準陽性血清、陰性血清及禽流感病毒血凝抑制抗原(杭州杰萌動物疫病防控科技有限公司)，總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒(Aidlab，北京)。

1.3 試驗設計

1日齡雛雞1 500只，隨機分為3組，每組500只，其中：對照組飼喂基礎飼糧，蟬花多糖組在基礎飼糧中按0.5 g/kg添加蟬花多糖(相當于添加蟬花粗多糖1.12 g/kg)，蟬花菌絲體組在基礎飼糧中按20 g/kg添加蟬花菌絲體(相當于添加蟬花粗多糖2.84 g/kg)。試驗期為51 d。

1.4 飼養管理

雞群自由攝食飲水，每天早晚添加相應的飼料2次。地面散養，自然光照，每天觀察雞采食及精神狀態。飼料由溫州正泰農牧有限公司提供，基礎飼糧組成及營養水平見表1。5日齡法氏囊疫苗飲水免疫，13日齡新城疫活疫苗點眼免疫，19日齡禽流感疫苗肌肉注射，29日齡新城疫活疫苗點眼免疫，45日齡新城疫活疫苗點眼免疫。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 禽流感抗體水平檢測

在27、37、51日齡(即首免后1、2.5和4.5周)每組抽取20只試驗雞翅靜脈采血，3 500 r/min離心5 min，抽取上層血清放置-20℃保存備檢。依據《高致病性禽流感診斷技術》(GB/T 18936—2003)采用微量HI試驗方法測定禽流感抗體水平[10]。

1.5.2 細胞因子含量測定

血樣采集及處理同1.5.1。ELISA測定血清樣本TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量，詳細步驟參考試劑盒說明書。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.5.3 基因表達差異檢測

51日齡時，每組隨機抽取3只，采血完畢后迅速剖殺，無菌采取脾臟，放入凍存管并保存于液氮，后轉移至-80 ℃冰箱待基因表達檢測。全部脾臟組織樣品總RNA參照試劑盒操作說明進行，檢測RNAOD值，計算濃度，通過A260/A280比值檢測純度。組織樣品cDNA反轉錄參照試劑盒操作說明進行，-80 ℃保存。

使用熒光定量PCR試劑盒，反應體系為10 μL：2×SYBR?Green Supermix 5.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板 1.0 μL，RNase Free dH2O補足至10.0 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，根據表2中引物退火溫度58 ℃退火30 s，39個循環；融解曲線分析程序為60～95 ℃，每循環一次增加1 ℃，持續4 s。以Actin為內參基因，對目的基因IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的mRNA表達量進行檢測分析。各基因和內參基因引物序列詳見表2，引物由北京百邁客生物科技有限公司合成。

1.6 數據處理與統計分析

采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，組間采用LDS法進行差異性顯著性檢驗。試驗數據用“平均值±標準誤”表示。

表2 引物序列

2 結果

2.1 蟬花多糖對禽流感抗體水平的影響

由表3可知，51日齡時，蟬花菌絲體組的H5-Re8抗體水平較對照組有所升高(P<0.05)，27～51日齡，對照組H5-Re8抗體水平在3組中下降最快，而蟬花菌絲體組下降最慢。27～51日齡，各組H7N9抗體水平都呈先升后降的趨勢，蟬花多糖組和蟬花菌絲體組H7N9抗體水平峰值較對照組更高；在37～51日齡，對照組H7N9抗體水平下降了7.1%，而蟬花菌絲體組的H7N9抗體水平僅僅下降了3.4%。表明在飼料中添加蟬花多糖不僅不同程度地提高了禽流感抗體水平，而且將抗體水平維持了更長的時間。

表3 27～51日齡各組雞 H5-Re8、H7N9抗體水平 log2

2.2 蟬花多糖對血清細胞因子水平的影響

由表4可知，蟬花多糖組51日齡IL-1含量顯著高于對照組；蟬花多糖組、蟬花菌絲體組IL-2含量較對照組都有不同程度上升(P>0.05)；27日齡，蟬花多糖組IL-4含量顯著高于對照組和蟬花菌絲體組(P<0.05)，51日齡，蟬花菌絲體組IL-4含量最高，且蟬花多糖組和蟬花菌絲體組均顯著高于對照組(P<0.05)；27、51日齡，蟬花多糖組、蟬花菌絲體組IL-6含量與對照組相比有所升高(P>0.05)； 27日齡，蟬花多糖組、蟬花菌絲體組IFN-γ含量比對照組顯著升高(P<0.05)；蟬花多糖組、蟬花菌絲體組27～51日齡TNF-α含量較對照組有不同程度上升，其中27、51日齡蟬花多糖組、37日齡蟬花菌絲體組均比對照組顯著升高(P<0.05)。

結果顯示，通過添加蟬花多糖，機體可誘導分泌IL-4、TNF-α等多種細胞因子參與細胞免疫，IL-4等細胞因子介導體液免疫，兩者在平衡狀態下，能有效維持和提高機體免疫功能水平[11]。

表4 蟬花多糖對血清細胞因子水平的影響 pg/mL

2.3 蟬花多糖對免疫相關基因表達量的影響

根據圖1可知，蟬花多糖組和蟬花菌絲體組脾臟細胞TNF-α、IL-2表達均有所降低，且TNF-α的表達顯著低于對照組(P<0.05)；蟬花菌絲體可促進脾臟細胞IFN-γ、IL-4的表達，但與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

注：相同基因組間比較，無字母或字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 蟬花多糖對三黃雞禽流感抗體水平的影響

前期試驗表明，蟬花多糖能提高雛雞新城疫疫苗免疫抗體水平和成活率[12]。禽業致命的打擊除了雞新城疫還有禽流感病毒，中草藥多糖能調節免疫功能、提高機體對外來侵入病菌的抵抗力，且具有毒副作用小等優點[13]。本試驗結果顯示蟬花菌絲體組禽流感H5抗體水平顯著高于對照組，提示蟬花多糖可能有提高動物機體體液免疫的作用。劉娜等[14]研究發現，松花粉多糖對禽流感的免疫有增強作用。

3.2 蟬花多糖對三黃雞血清細胞因子水平的影響

白細胞介素參與機體內多種生理病理過程[15]。Th1類細胞調節細胞免疫，參與機體抗毒、抗癌；Th2類細胞是參加體液免疫，促進抗體產生[16]，兩類細胞的平衡在自身免疫性疾病中發揮重要作用[17]。IL-4具有多種免疫功能，包括輔助Th細胞進行分化、先天免疫應答的過程，且促進活化的T細胞生長[18]。在本試驗中，試驗組與對照組相比，IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量都有不同程度的升高，試驗前期蟬花多糖組IL-4含量顯著升高，試驗后期蟬花菌絲體組IL-4含量呈顯著升高。表明蟬花多糖和蟬花菌絲體多糖可能通過誘導機體免疫細胞產生IL-4等細胞因子，從而增強體液免疫功能。研究發現，隨著IL-4細胞因子含量的升高，同期H5-Re8、H7N9抗體水平比對照組相應提高，表明蟬花多糖能激發Th2類細胞提高體液免疫水平。Huang等[19]研究發現，靈芝多糖和豬苓多糖能顯著增強小鼠機體內巨噬細胞的吞噬功能和NK細胞的活性。

早期試驗多糖用于雞生產,有助于促進生長、提升血清中干擾素等分泌水平等積極增強免疫的作用[20]。TNF-α、IFN-γ等細胞因子參與細胞免疫[21-22]；滕麗花等[23]證實，多種中草藥多糖(黃芪、魚腥草等)都能刺激細胞因子產生，提高機體巨噬細胞的吞噬作用，從而增強機體免疫力，發揮中草藥多糖抗感染等作用。本試驗研究結果表明，蟬花多糖組和蟬花菌絲體組TNF-α含量有顯著升高。

3.3 蟬花多糖對三黃雞免疫相關基因表達量的影響

脾臟類屬外周免疫器官，是機體免疫應答的主要場所之一,雞脾臟基因表達分子水平一定程度上反應雞免疫調節機理。IFN-γ具有激活且促進巨噬細胞功能、激活中性粒細胞功能等作用[24]。本試驗結果顯示，蟬花菌絲體組脾臟IFN-γ、IL-4基因含量高于對照組。這與敖艷華等[25]的試驗結果相似，提示IFN-γ的升高能增強機體的體液免疫，禽流感免疫后抗體水平維持更久。多糖能促進淋巴細胞分泌IFN-α、IL-2等多種與免疫相關的因子產生，可能與IFN-γ發揮著較強的免疫調節功能相關，能增強H5亞型雞禽流感疫苗的免疫作用，從而保護機體的免疫系統[26]。

4 結論

在三黃雞雛雞階段飼喂蟬花多糖或蟬花菌絲體能提高雞禽流感疫苗抗體水平，可作為增強免疫型添加劑進一步開發利用。雖然蟬花多糖的生產成本是蟬花菌絲體的7倍，但蟬花菌絲體劑量是蟬花多糖的40倍，結合藥物劑量和生產成本，蟬花多糖推廣應用價值更高。