1株H9N2亞型禽流感變異株HA基因遺傳演化分析及反向遺傳操作系統的建立

范夢璐，田苗，趙永振，平繼輝

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype AIV)自1966年從北美的火雞體內首次被分離以來，已在全世界范圍內廣泛傳播。1994年，在我國廣東省分離到第1株H9N2亞型AIV[1-2]。隨著該亞型病毒的不斷傳播和進化，H9N2 AIV已在我國家禽中成為流行最為廣泛的流感病毒亞型。雖然H9N2亞型AIV感染家禽后僅表現出較低的致病性，但與其他病原體混合感染時會導致嚴重發病，給家禽業造成重大的經濟損失[3]。疫苗接種是我國防控H9N2 AIV采取的最普遍的手段，研究表明，AIV在疫苗選擇壓力下正在不斷發生重組和變異[4-5]。HA和NA是流感病毒表面的2種糖蛋白，是決定病毒抗原性的重要基因，HA基因上某些氨基酸位點的改變與流感病毒變異和致病性密切相關[6-7]。

病毒的反向遺傳技術，又被稱為病毒拯救，是通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上對其進行體外操作并拯救出具有活性的病毒粒子，從而研究病毒基因結構與功能的方法[8]。Neumann等[9]在1999年建立了流感病毒的12質粒反向遺傳系統，將病毒8種vRNA片段的cDNA克隆到人RNA聚合酶Ⅰ啟動子和鼠RNA聚合酶終止子之間，在轉染8個vRNA片段的質粒DNA同時，共轉染聚合酶(PB2，PB1和PA)以及核蛋白NP的蛋白表達質粒，在4個蛋白表達質粒所形成的聚合酶驅動下，轉錄出8個病毒RNA片段，進而形成病毒的最小復制單位核糖核蛋白復合體(vRNPs)，隨后包裝出病毒粒子，因此流感病毒的“12質粒系統”具有很高的病毒拯救效率。

本研究從江蘇省某養雞場發病雞體內分離到1株H9N2亞型AIV，命名為A/chicken/Jiangsu/76/2018 (H9N2, JS/76)，該雞場具有比較完善的禽流感疫苗免疫程序，定期進行疫苗接種，提示該分離株可能為變異毒株。針對該病毒HA基因進行序列測定和遺傳演化分析發現，JS/76仍屬于A/duck/Hong Kong/Y280/97分支。本研究成功建立了低致病性H9N2亞型AIV的反向遺傳系統，通過測定病毒TCID50、EID50、生長曲線和受體親和性證明拯救病毒的生物學特性與野生毒株完全一致，為進一步研究JS/76 AIV的生物學特性以及致病機制提供了依據。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞和病毒

流感病毒RNA轉錄載體pHH21及大腸桿菌DH5α感受態細胞由本實驗室保存； MDCK和293T細胞由本實驗室保存；9～11日齡SPF雞胚購自天邦生物技術股份有限公司。

本研究使用AIV毒株A/chicken/Jiangsu/76/2018從江蘇省某養殖場發病雞體內分離，經SPF雞胚連續3次有限稀釋進行純化，并在SPF雞胚上增殖一代，保存于-80 ℃冰箱備用。對照毒株A/California/04/2009 (H1N1, Cal/04) 和A/chicken/Shandong/6/1996 (H9N2, SD/6/96) 由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

Phonta Max Super-Fidelity DNA酶、T4 DNA 連接酶、ClonExpress II One Step Cloning Kit和RNA isolater Total RNA Extraction Reagent等試劑(盒)購自南京諾唯贊公司；質粒DNA中提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；膠回收試劑盒以及DNA清潔回收試劑盒購自AxyPrep公司；限制性內切酶購自NEB公司；DNA Marker DL2000和DNA Marker DL5000均購自TaKaRa；胎牛血清、Opti-MEM減血清培養基、LipofectamineTM2000和DMEM培養液購自Invitrogen公司；TPCK胰酶以及FITC鏈霉親和素均購自Sigma-Aldrich；Alexa Fluor?647 標記山羊抗小鼠IgG (H+L) 購自福麥斯生物；M2 E10單克隆抗體、6’SLN和6’sDi-LN2種唾液酸糖鏈由內蒙古大學王國俊教授惠贈。

1.3 HA基因的關鍵性位點分析和進化樹繪制

用Lasergene 9.0中的MegAlign軟件對H9N2分離株的HA基因序列與流感病毒數據庫中的H9N2禽流感參考毒株的HA基因序列進行比較和分析。參考毒株HA基因登錄號分別為：A/chicken/Anhui/LH66/2017 (H9N2):MH489443; A/chicken/Guangxi/55/2005 (H9N2):EU086245; A/chicken/Shanghai/F/1998 (H9N2):AY743216; A/chicken/Hong Kong/G9/1997 (H9N2):KF188366; A/duck/Hong Kong/Y280/1997 (H9N2):AF56376; A/chicken/Shandong/6/1996 (H9N2):DQ064376; A/chicken/Beijing/1/1994 (H9N2):AF156380。使用Mega 7.0.26軟件繪制病毒HA基因的進化樹，根據文獻[10]分析分離株的關鍵性氨基酸位點。

1.4 引物設計與合成

利用Oligo7.0軟件設計擴增流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因全長的特異性引物及流感病毒反轉錄通用引物PolI-U12：CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGG，引物由通用生物系統(安徽)公司合成，引物序列信息見表1。

表1 H9N2亞型AIV 8個基因片段的感染性克隆構建引物

1.5 病毒RNA的提取、反轉錄以及目的片段擴增

參照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 試劑使用說明書進行病毒RNA抽提，采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒通過流感病毒反轉錄通用引物PolI-U12進行cDNA的反轉錄。利用基因特異性引物以cDNA為模板對JS/76的8個片段進行PCR擴增，PCR產物經電泳后使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。

1.6 感染性克隆質粒的構建

使用限制性內切酶BsmBⅠ對pHH21載體質粒進行酶切處理，同時利用BsmBⅠ或BsaⅠ限制性內切酶對8個基因片段進行酶切處理后，利用T4 DNA 連接酶將線性化的pHH21載體和目的基因片段進行連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞，并篩選陽性克隆送至南京擎科生物科技有限公司測序。使用不含內毒素的質粒DNA提取試劑盒提取JS/76的8個基因片段的陽性克隆質粒，8個轉錄質粒分別命名為pHH21-JS/76-PB2、pHH21-JS/76-PB1、pHH21-JS/76-PA、pHH21-JS/76-HA、pHH21-JS/76-NP、pHH21-JS/76-NA、pHH21-JS/76-M以及pHH21-JS/76-NS。

1.7 293T細胞轉染與病毒的拯救

使用LipofectamineTM2000 轉染試劑介導外源質粒進入細胞內，利用“12質粒系統”進行病毒拯救。12個質粒分別為：上述8個病毒RNA轉錄質粒以及4個蛋白表達質粒pCAGGS-WSN-PB2、pCAGGS-WSN-PB1、pCAGGS-WSN-PA和pCAGGS-WSN-NP。

病毒拯救的具體步驟如下：將8個轉錄質粒(200 ng/質粒)和4個蛋白質表達質粒(1 000 ng/質粒)混勻后，與12 μL LipofectamineTM2000 轉染試劑混合，在室溫孵育30 min后，加入到密度為70%的單層293T細胞中，放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養；轉染6 h后棄去轉染上清，并加入2 mL新鮮的Opti-MEM(含有1 μg/mL的TPCK-Trypsin)，37 ℃ 繼續培養。48 h后將轉染上清接種至9～11日齡SPF雞胚的尿囊腔，0.2 mL/胚，置于37 ℃ 增殖48 h，收集尿囊液，用1%的雞紅細胞測定病毒的血凝價，將有血凝活性的尿囊液收集并分裝，-80 ℃保存備用。

1.8 獲救病毒的鑒定

對獲救病毒RNA進行提取、片段擴增以及測序，測序結果使用Lasergene 9.0軟件套裝中的SeqMan軟件進行序列拼接并通過與親本病毒基因組的比較來判定拯救的病毒的正確性。

1.9 EID50和TCID50滴度的測定

按照Reed-Muench 方法，測定拯救毒株與親本毒株的雞胚半數感染量(EID50)和半數組織培養感染劑量(TCID50)。數據使用GraphPad Prism 8.0.1.2軟件進行處理并用“平均數±標準差”表示，利用t檢驗方法進行差異顯著性分析。

1.10 病毒在SPF雞胚和MDCK細胞上的復制

拯救病毒和野生型病毒分別以2×103EID50的感染量接種18枚9日齡SPF雞胚，在接種后12 、24、36、48、60和72 h分別取3枚雞胚，測定其HA滴度并取平均值代表病毒在該時間點的復制情況，利用GraphPad Prism 8.0.1.2軟件處理數據并繪制復制曲線。

拯救病毒和野生病毒分別以MOI=0.01的病毒量感染培養于6孔板中的密度為95%的MDCK細胞，每個病毒3個重復，分別在12、24、36、48、60和72 h收取細胞上清液存于-80 ℃冰箱，待所有樣品收集完畢后測定其HA滴度，利用GraphPad Prism 8.0.1.2軟件處理數據并繪制病毒的生長曲線。

1.11 受體結合試驗

使用Cal/04病毒作為人流感病毒受體結合特征的對照，SD/6/96作為禽流感病毒受體結合特征的對照。未感染病毒的細胞為MOCK組空白對照。將對照組病毒、拯救病毒和野生病毒分別以MOI=1的劑量感染6孔板中95%密度的單層MDCK細胞，感染24 h后，胰酶消化感染細胞(包括MOCK組和感染組的細胞)，用冷PBS洗滌細胞3次后，重懸于500 μL的PBS中，之后將細胞加入96孔V型板中，每孔100 μL。分別加入2種α-2,6唾液酸糖鏈(6’SLN和6’sDi-LN)以及M2 E10抗體，4 ℃孵育2 h，用PBS洗滌2次后，每孔中分別加入FITC鏈霉親和素和Alexa Fluor?647 標記山羊抗小鼠IgG (H+L) 抗體，4 ℃孵育2 h，PBS洗2遍后，1 mL PBS重懸，流式細胞儀進行測定，FlowJo軟件進行結果分析。

2 結果

2.1 HA基因遺傳演化及關鍵氨基酸位點分析

JS/76分離株在SPF雞胚上進行3次有限稀釋純化后，提取病毒的RNA，RT-PCR擴增其HA基因之后進行序列測定，與美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫所獲得的參考毒株核苷酸序列進行對比，繪制病毒HA基因的進化樹。結果如圖1所示，JS/76分離株位于Y280分支，與湖南、山東、江蘇、江西等地的H9N2分離株相距較近，其變異程度主要與時間相關，與宿主和地理位置關系較小。對JS/76的HA氨基酸序列的關鍵性位點進行分析(表2)，JS/76毒株在315～323位的裂解位點為PSRSSR↓GLF，無多個連續堿性氨基酸，表明其具有LPAIV的分子特征。對其受體結合位點分析發現，JS/76的受體結合位點發生了E180T和Q216L的突變，表明可能已具備人源病毒的受體結合特征。在91、143、145、173、184和185位氨基酸與參考毒株一致，分別為Y、W、T、N、L和Y。潛在糖基化位點分析顯示，JS/76毒株在11、123、127、280、287、295、474和533位有8個潛在糖基化位點，其中127位氨基酸與參考毒株相比多了一個潛在糖基化位點NGT，在200位少了一個潛在糖基化位點NRT。

2.2 感染性克隆質粒的構建

提取病毒的RNA，進行反轉錄，用帶有酶切位點的引物進行PCR擴增，酶切后克隆到pHH21載體，挑選單菌落37℃搖床培養后提取質粒，結果如圖2A所示，8個基因片段的感染性克隆的大小均符合預期，進行PCR鑒定發現，8個質粒均能擴增出位置正確、條帶單一的條帶(如圖2B所示)。經測序分析發現，所構建的重組質粒所攜帶的目的基因序列與JS/76基因序列完全一致，表明成功獲得了JS/76病毒8個基因的感染性克隆。

2.3 病毒的拯救與鑒定

利用流感病毒的“12質粒系統”進行JS/76的拯救，將LipofectamineTM2000轉染試劑與構建好的重組質粒轉入已準備好的生長密度為70%～80%的單層293T細胞中。轉染48 h后收集細胞上清接種9～11日齡SPF雞胚，48 h后收獲尿囊液，測定血凝活性為陽性，拯救的病毒命名為r-JS/76。提取病毒RNA、反轉錄、PCR擴增8個基因片段并進行序列測定，與JS/76基因組序列比對發現，r-JS/76基因序列與野生病毒JS/76序列完全一致，證明病毒拯救成功。

表2 JS/76 毒株HA序列關鍵性氨基酸位點分析

注：以A/turkey/Wisconsin/1966 (H9N2) 為進化樹的樹根。●表示本研究中分離株JS/76，■表示經典代表毒株，▲表示疫苗毒株

M. DL5000 DNA Marker; 1～8.依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的陽性質粒和PCR擴增產物

2.4 拯救病毒r-JS/76和野生病毒JS/76的病毒滴度測定

分別測定r-JS/76和JS/76的病毒滴度，將r-JS/76病毒接種MDCK細胞，測得其滴度為(7.34±0.10)lgTCID50/mL，親本病毒JS/76的滴度為(7.12±0.23)lgTCID50/mL。將r-JS/76和JS/76分別接種9日齡SPF雞胚，測定其在雞胚上的滴度分別為(9.56±0.11)lgEID50/mL和(9.31±0.15)lgEID50/mL，結果統計分析無顯著性差異，表明拯救病毒的增殖特性未發生改變。

2.5 r-JS/76和JS/76病毒在雞胚和細胞上復制特性分析

將拯救病毒r-JS/76和親本病毒JS/76分別以2×103EID50的感染量接種SPF雞胚，然后在不同的時間點收獲尿囊液，測定病毒血凝價，比較2個病毒在雞胚中的復制能力。統計分析結果顯示，野生型毒株JS/76與其拯救株r-JS/76在各個時間點的復制滴度基本一致，r-JS/76病毒復制滴度略高于親本毒株，但無顯著性差異(圖3A)。

JS/76和r-JS/76以MOI=0.01的劑量感染MDCK細胞，不同的時間點收獲細胞上清測定其血凝價，比較2個病毒在MDCK細胞中的復制能力。通過差異顯著性分析，拯救株r-JS/76比野生型毒株JS/76在細胞上的復制水平略高，但無顯著性差異(圖3B)。因此，拯救病毒r-JS/76在SPF雞胚和MDCK細胞上保留了與JS/76相似的復制特性。

圖3 拯救毒株r-JS/76和親本毒株JS/76在SPF雞胚(A)和MDCK細胞(B)的復制動力學分析

2.6 r-JS/76和JS/76病毒的受體結合特性分析

JS/76和r-JS/76以MOI=1的劑量感染MDCK細胞，在24 h后收集感染細胞，利用相應糖鏈和抗體處理后，流式技術檢測細胞的陽性率，結果如圖4 A所示，與MOCK組相比，對照組的2個病毒Cal/04和SD/6/96能夠檢測到的細胞陽性率分別為72.2%和85.7%，試驗組r-JS/76和JS/76檢測到的細胞陽性率分別為89.6%和90.1%，說明MDCK已經被病毒有效感染并能夠通過相應抗體檢測到。通過檢測與2種α-2,6唾液酸糖鏈的結合效率發現(圖4 B)，Cal/04具有α-2,6唾液酸受體親和性，而SD/6/96無α-2,6唾液酸受體親和性，與這2株病毒本身分別具備人源受體結合特性及禽源受體結合特性完全一致。與對照組相比，r-JS/76和JS/76兩個病毒也能夠檢測與6’sDi-LN糖鏈結合，說明這2株病毒已經獲得人源受體親和特征。

圖4 拯救毒株r-JS/76和親本毒株JS/76流式細胞陽性結果(A)及人源受體親和性分析(B)

3 討論

近年來發現，H9N2亞型AIV能夠為多種新型流感病毒提供內部基因或與高致病性流感病毒重組，從而增強流感病毒的毒力和感染范圍[11-12]。文獻報道，近期分離到2株廈門分離株的內部基因與H10及H7亞型親緣關系最近，分離株為四重重組體，進化程度與時間相關性較大，進化方向已突破地域和宿主的特點[13]，因此H9N2亞型AIV已經成為公共安全的潛在威脅。H9N2亞型AIV能夠逃避宿主機體的免疫能力，對宿主構成持續的威脅，主要原因就是病毒的表面蛋白血凝素HA和神經氨酸酶NA在不斷發生變異，使病毒容易發生抗原漂移和抗原轉變[10, 14-15]。表面蛋白HA是宿主免疫系統識別的主要靶蛋白之一，能夠誘導機體產生免疫反應，產生中和抗體。HA的特異性抗體主要針對頭部球狀結構域。抗原表位、受體結合區以及其他頭部氨基酸替換都會對流感病毒的抗原性、受體親和性以及病毒毒力產生影響[16-17]。本研究通過對JS/76分離株的HA基因進行遺傳演化分析以及關鍵氨基酸位點分析，發現JS/76毒株屬于Y280-like分支。研究發現同一時期不同區域H9N2毒株之間進化距離相近，HA基因的變異情況和地域無相關性，可能與時間推移具有相關性[18]。另外，從進化樹中可以看出，JS/76 AIV HA基因序列與參考毒株和常用疫苗株的距離較遠，可能是在疫苗免疫壓力和自然選擇下，加速了H9N2亞型AIV的變異速度。

HA蛋白受體結合區氨基酸的改變，會影響流感病毒與禽源/人源宿主細胞受體的結合能力。在先前的報道中，Q216L位點氨基酸發生變異，是H9N2亞型AIV由禽源受體親和性向人源受體親和性改變的一個先決條件[19-20]。本研究中，JS/76毒株的HA基因216位氨基酸為亮氨酸，與參考毒株相比，已經具備了與人源α-2,6唾液酸受體結合的特征。病毒表面蛋白HA糖基化缺失或增加會影響流感病毒的毒力或者抗原性。Gao等[21]和Herfst等[22]研究發現H5N1 AIV HA蛋白158N糖基化位點的缺失有助于病毒在雪貂上呼吸道的復制，促進H5N1病毒在豚鼠中的直接接觸傳播以及在雪貂中的水平傳播。有研究表明國內多數H9N2亞型 AIV HA蛋白有7個毒力相關的糖基化位點(含N-X-S/T，X為除P以外的氨基酸)[2]。本研究中JS/76毒株HA基因的127～129位氨基酸獲得一個額外的潛在糖基化位點，該突變是否形成糖基化以及對病毒的生物學特性影響還有待進一步研究。

目前，反向遺傳技術已經非常成熟，該技術已應用于多種負鏈RNA病毒的研究，在病毒基因組的表達調控機制、分子致病機理研究以及新型疫苗研制上發揮著重要作用[23-24]。本研究利用流感病毒反向遺傳的“12質粒系統”，將野生毒株的8個基因片段分別克隆到流感病毒vRNA表達載體pHH21上，與4個蛋白表達質粒共轉染293T細胞，組裝出具有感染性的病毒粒子，然后在雞胚中大量增殖，從而成功拯救r-JS/76病毒。通過基因測序、病毒滴度測定以及病毒在SPF雞胚和MDCK細胞上的復制等方面的比較，拯救病毒r-JS/76與野生病毒JS/76具有相同的生物學特性；通過受體結合試驗證明，拯救病毒和親本病毒受體特性保持一致，2個病毒都已具有人源受體親和特征。本研究中r-JS/76病毒反向遺傳系統的建立，為后續在分子基礎上進行基因替換或基因定點突變、深入研究JS/76 AIV 的變異機制以及對跨宿主感染能力搭建了平臺，同時也為JS/76 AIV 的宿主適應性和新型疫苗研發奠定了基礎。