禽腺病毒4型ZZ株的致病性研究

金前躍，王寅彪，柴永笑，盧清俠，郭振華，羅俊，邢廣旭，鄧瑞廣，張改平,6

(1. 河南省農業科學院/動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2. 河南省農業科學院/中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；3. 江蘇高校動物重要疾病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；4. 新鄉醫學院公共衛生學院，河南 新鄉 453003；5. 西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100；6. 河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002)

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，是感染家禽和野禽的常見病原，一般僅造成輕微癥狀，致病性較強的FAdVs可引起雞包涵體肝炎(inclusion body hepatitis，IBH)、肌胃糜爛(gizzard erosions，GE)和心包積液綜合征(hydropericardium syndrome，HPS)等[1-2]。FAdV病毒粒子呈球形，直徑70～90 nm，是一種無囊膜雙股線性DNA病毒，基因組全長在40～46 kb，基于全基因組的限制性片段長度多態性分析及交叉中和試驗分別可將FAdVs分為A、B、C、D、E 5個種，12個血清型(1～8a，8b～11)[1]。其中，A種包括FAdV-1型，B種包括FAdV-5型，C種包括FAdV-4型和FAdV-10型，D種包括FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9、FAdV-11型，E種包括FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b型。FAdV編碼的主要結構蛋白包括六鄰體蛋白(hexon)、五鄰體蛋白(penton)以及纖維蛋白(fiber)。Hexon蛋白是病毒表面含量最高的蛋白，能夠誘導中和抗體產生[3-4]?；趆exon基因序列的系統進化分析常被用于FAdVs的血清型分型，這是因為要獲得所有血清型FAdV病毒的陽性血清比較困難，交叉中和試驗不能被廣泛應用[5]。Penton蛋白在病毒入侵細胞過程中發揮重要作用，也能誘導中和抗體產生[6-7]。Fiber蛋白與penton蛋白非共價相連，是介導病毒與宿主細胞表面受體結合的蛋白，能夠誘導保護性免疫應答產生，并與病毒的組織嗜性和毒力密切相關[8]。FAdV的血清A型和C型可編碼2個fiber蛋白，而血清B型、D型和E型僅編碼1個fiber蛋白[9]。

2014年以來，FAdV感染引起的IBH和HPS病例在國內雞群中不斷出現且呈逐漸增加的趨勢，對養禽業造成了巨大影響[10-11]。流行病學調查發現，國內目前存在著FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E感染，分布在肉雞、蛋雞、鴨、鵝、鴕鳥等禽類群體中[5, 12]。河南的HPS病例于2015年出現在豫東地區的肉雞群中，目前全省大多數地區均有發生，死亡率達30%～80%[13-14]。在FAdVs的12個血清型中，FAdV-4型是引起HPS的主要病原體[15]。本實驗室在2016年從新鄭某雞場采集的HPS病雞樣品中分離獲得了1株禽腺病毒血清4型病毒株，命名為FAdV-4 ZZ株。與無毒力的FAdV-4 ON1和FAdV-4 KR5株相比，FAdV-4 ZZ株存在ORF19、ORF27和ORF30基因缺失。與國內最早分離的FAdV-4 JSJ13株相比，FAdV-4 ZZ的ORF29序列存在33 nt核苷酸缺失[11]。FAdV-4 ZZ株的hexon基因與ON1和KR5的hexon基因核苷酸序列相似性分別為98.69%和98.90%；penton基因與ON1和KR5的penton基因核苷酸序列相似性分別為98.99%和98.86%；fiber1基因與ON1和KR5的fiber1基因核苷酸序列相似性分別為95.93%和96.86%；fiber2基因與ON1和KR5的fiber2基因核苷酸序列相似性分別為95.85%和95.90%。這些變異可能說明病毒在進一步適應宿主，但尚不清楚它們對FAdV-4病毒復制、毒力及細胞嗜性的影響。

本研究利用FAdV-4 ZZ病毒株感染SPF雞，對感染后雞的臨床癥狀、存活率、組織病理學變化、病毒的組織分布情況進行了分析，確定了該毒株的致病性，為探索其致病機制并有效防控HPS病例的發生奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

18日齡的無特定病原體(SPF)雞購自北京梅里亞維通實驗動物中心，雞肝癌細胞系(LMH)、標準質粒(pEASY-Blunt-Hexon)由本實驗室保存。FAdV-4 ZZ株分離于河南鄭州(新鄭)某雞場，利用LMH細胞穩定傳代后保存于實驗室。

1.2 主要試劑

FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)購自Roche公司；病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、PremixExTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；DME/F12培養基購自HyClone公司；組織細胞固定液、青鏈霉素混合液和胰蛋白酶購自Solarbio公司；胎牛血清購自Gibco公司；0.22 μm濾器購自Merck Millipore公司；QIAamp 96 DNA QIAcube HT Kit購自德國QIAGEN公司。

1.3 病毒的增殖培養

待細胞瓶中的LMH細胞生長至約80%時，棄去培養基并用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，之后接種FAdV-4 ZZ株病毒，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養1.5 h。然后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養基繼續培養72 h。-80 ℃與室溫間反復凍融后，2 000 r/min離心15 min，收集病毒液。過濾后，再次接種于LMH細胞進行傳代，以擴增病毒。

1.4 病毒的半數感染劑量測定

待96孔細胞培養板中的LMH細胞生長至約80%時，棄去培養基，PBS洗滌3次，向各列細胞孔中加入100 μL按10-1～10-10連續10倍倍比稀釋的病毒液，孵育1.5 h后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養基，最后2列細胞孔留作陰性對照，于含5% CO2的37 ℃培養箱中培養96 h，記錄各稀釋度細胞病變孔數，使用Reed-Muench法計算FAdV-4病毒的半數感染劑量(TCID50)。

1.5 病毒致病性試驗

將SPF雞只隨機分為病毒感染組和PBS對照組，每組各10只。通過肌肉注射給感染組SPF雞注射100 μL的FAdV-4 ZZ株病毒(105.0TCID50/0.1 mL)，PBS對照組以相同方式每只接種100 μL無菌PBS。每日觀察雞的臨床癥狀，剖檢死亡雞，記錄病理變化并采集內臟器官。從組織樣品中提取病毒DNA進行熒光定量PCR檢測以確定感染后病毒的組織分布情況；同時采集感染組病死雞和對照組雞的心、肝、脾、肺、腎、腺胃、十二指腸、法氏囊等組織制作病理切片，進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下觀察各組織的病理學變化。

1.6 SYBR Green I熒光定量PCR

根據GenBank中FAdV ZZ株(MN337322.1)的序列，設計特異擴增hexon基因的SYBR Green I熒光定量PCR引物，上游引物：CGAGGACTACGACGATTA，下游引物：CGTGATACAGCAGGTTAATG，引物由上海生工生物工程公司合成。實時熒光PCR的反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環40次。溶解曲線分析設置為：95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，結束。

將標準質粒按10倍梯度稀釋，得到109～102拷貝/μL系列標準模板，采用上述反應程序進行熒光定量PCR反應，并繪制標準曲線，樣品病毒拷貝數根據標準曲線計算獲得。

2 結果與分析

2.1 病毒滴度

將收獲的病毒液做10倍倍比稀釋，感染生長于96孔板中的LMH細胞，96 h讀數按照Reed-Muench法得到病毒液的TCID50為107.8TCID50/0.1 mL。

2.2 臨床癥狀

感染后0～24 h，所有SPF雞呈正常狀態。到48 h 時，FAdV-4 ZZ株感染組有一半的雞開始出現精神抑郁、嗜睡、食欲不振等癥狀；嚴重者出現頭首啄地、閉眼不睜、流涎、肛門處羽毛與糞便粘連、綠便等癥狀；隨后48 h內，其余雞陸續出現上述嚴重癥狀，直至死亡。整個試驗周期內，PBS對照組SPF雞未出現任何異常癥狀。

2.3 攻毒后的存活率

FAdV-4 ZZ株感染組在攻毒后48～60 h間，雞開始死亡，死亡數占50%；之后，每隔12 h，都有雞死亡，到96 h時，所有感染雞全部死亡；PBS對照組在整個試驗過程中沒有雞死亡(圖1)。

圖1 攻毒后的雞只存活曲線

2.4 剖檢變化

將PBS對照組正常雞和FAdV-4 ZZ株感染組死亡雞全部進行解剖觀察，結果發現FAdV-4 ZZ株感染組病死雞全部可見心包積液(圖2A)和肝臟變黃腫大(圖2B)等典型的病理變化；而對照組雞正常，未出現任何病變特征(圖2C)。

2.5 攻毒后的組織病變

經HE染色后，與對照組雞相比，感染組病死雞除十二指腸外，各組織均呈現出一定的組織病理學變化(圖3)。心肌細胞有壞死現象，肌纖維間出現淋巴細胞浸潤(圖3A)；肝組織出現彌漫性的灶性壞死，肝細胞內存在包涵體，并且肝細胞核碎裂、溶解，并伴有散在的炎性細胞浸潤(圖3B)；脾臟實質細胞呈現點狀凋亡或壞死，出現細胞核固縮、碎裂，但整體結構改變不明顯(圖3C)；肺組織血管內可見炎性細胞增多，肺間質出現水腫和少量的炎性細胞浸潤(圖3D)；腎臟可見廣泛彌漫性的腎小管上皮細胞水腫，胞質疏松(圖3I)；腺胃可見排列規則整齊的復合管狀腺，復合管腺腔內可見少量的滴狀物，腺管上皮細胞出現點狀壞死(圖3J)；十二指腸腸黏膜層絨毛排列整齊規則，腸腺豐富，排列規則，腸各層結構清晰緊密，未見明顯異常(圖3K)；法氏囊胸腺小葉結構尚在，小葉中皮髓質分界不清楚，皮髓質中淋巴細胞大量壞死減少，排列稀疏紊亂，并伴有中性粒細胞以及巨噬細胞等炎性細胞浸潤(圖3L)。

圖2 FAdV-4 ZZ株感染雞的病理變化

圖3 FAdV-4 ZZ株感染雞不同組織的組織學變化(HE染色，20×)

2.6 病毒的組織分布情況

熒光定量PCR檢測各組織的病毒載量后發現，感染組病死雞的心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、腺胃和心包積液中，都存在不同程度的病毒感染，肝組織中病毒載量最高，其次為肺，表明FAdV-4 ZZ株病毒具有廣泛的組織嗜性(圖4)。

圖4 FAdV-4 ZZ株感染后不同組織中的病毒載量

3 討論

2014年以來，國內雞群陸續出現了IBH和HPS病例，多發于5～11周齡，蛋雞、肉種雞和三黃雞都有發病[13,16]。發病雞剖檢后心包腔內有淡黃色積液，同時出現肺水腫、肝臟腫脹變色等病變。流行病學調查發現引起國內IBH病例的禽腺病毒為FAdV-8a/b型，引起HPS病例的禽腺病毒為FAdV-4型[16]。FAdV既可經雞胚垂直傳播，也可經糞口途徑水平傳播，從而對養禽業造成巨大影響[17]。劉亮亮等[18]研究發現國內商品化的新城疫弱毒苗中污染了FAdV-4型病毒，可能造成雞群大面積感染。Pan等[19]研究發現感染FAdV-4的鴨群可以不表現臨床癥狀，但能持續排毒，形成潛在的傳染源，病毒從鴨群向雞群傳播加大了HPS發生的風險和防控難度。

本實驗室2016年從患有HPS的病雞樣品中分離了1株FAdV-4病毒株(FAdV-4 ZZ株)，利用LMH細胞對病毒進行了培養，并獲得了病毒的全基因組序列(GenBank登錄號：MN337322.1)，研究發現FAdV-4 ZZ株能夠影響雞胚發育，造成內臟器官產生病變并使雞胚死亡。在此基礎上，本研究以FAdV-4 ZZ株感染SPF雞只，從存活率、剖檢結果、組織病理學變化、病毒的組織分布情況等方面對病毒的致病力進行了評價。

FAdV-4 ZZ株感染SPF雞96 h后，所有感染雞全部死亡。這說明FAdV-4 ZZ株對SPF雞有高致病性，與國內其他FAdV-4分離株的致死性結果相近[20]。剖檢發現感染組病死雞全部出現心包積液和肝臟變黃腫大等典型的病理變化，組織病理學也出現了HPS的典型變化。熒光定量PCR檢測顯示肝臟病毒載量最高，其他組織也檢測到不同程度的病毒存在，表明FAdV-4 ZZ株病毒具有廣泛的組織嗜性。與國內其他FAdV-4分離株感染SPF雞后的組織病毒載量結果相似[19-20]。

FAdV感染一般僅造成亞臨床癥狀，本研究致病性試驗獲得的臨床癥狀、存活率、剖檢結果、病理學變化、病毒組織分布情況等結果表明FAdV-4 ZZ株對雞群具有高毒力，這與國內其他FAdV-4分離株也具有高致病性的結論一致[11,21-22]。與無毒力的FAdV-4 ON1和FAdV-4 KR5株相比，FAdV-4 ZZ株存在ORF19、ORF27和ORF30基因缺失。與國內最早分離的FAdV-4 JSJ13株相比，FAdV-4 ZZ的ORF29序列存在33 nt核苷酸缺失[11]。深入研究這些基因變異對FAdV-4毒力增強產生的影響，是研發FAdV疫苗的關鍵。當前，加強養禽場生物安全、防止病毒在禽類群體中因交叉感染而持續存在，同時保障禽類疫苗中不污染FAdV，尤其是FAdV-4，是防控FAdV感染和HPS病例發生的重要措施。