犬子宮內膜基質細胞的分離培養與鑒定

倪珺，雷詩敏，羅麗平，謝國玉，劉序，芮榮

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

子宮疾病是危害犬類健康與繁殖性能的臨床常見疾病，嚴重者甚至威脅生命。近年來，我國寵物行業發展迅速，寵物犬飼養數量不斷增加，犬的健康日益受到寵物主人的重視。眾所周知，大多數子宮病變均與激素失調和細菌感染有關，而母犬生殖生理特點使其更易受微生物感染，引發生殖系統疾病[1]，其中子宮蓄膿發病率較高、危害較大，不及時治療可能引發母犬死亡，研究犬子宮內膜細胞的變化對闡明子宮疾病的發病機制具有重要意義。培養犬子宮內膜基質細胞，可為了解犬子宮內膜病變過程中基質細胞的生長代謝、相互作用和內分泌調控等提供有益的體外模型，國內有關犬子宮內膜細胞的分離培養鮮有報道。本試驗旨在通過優化基質細胞的分離培養程序，以期提高犬子宮內膜基質細胞體外培養的純度和成功率，為進一步探討犬子宮內膜相關疾病的發病機制提供有價值的體外細胞模型。

1 材料與方法

1.1 子宮組織樣本的來源

2018年9月至2019年12月從南京數家寵物醫院采集2～8歲進行子宮卵巢摘除術的健康犬子宮，摘取的子宮樣本立即放入4 ℃含雙抗(100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)生理鹽水中，2 h內送達實驗室進行分離培養操作。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清購自Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、臺盼藍均購自美國Sigma公司；100×青霉素-鏈霉素溶液購自Biosharp公司。鼠抗人波形蛋白(vimentin)抗體、鼠抗人細胞角蛋白(cytokeratin-18，CK-18)抗體購自北京Bioss公司。

1.3 犬子宮內膜基質細胞分離及原代培養

1.3.1 子宮組織樣本的處理

在超凈臺內無菌操作，先將子宮樣本移至滅菌燒杯中，剪除子宮周圍結締組織和脂肪，用含雙抗生理鹽水沖洗子宮外部血液等。沖洗干凈后，移至另一潔凈無菌平皿中，從一側子宮角沿子宮外壁縱向剖開，暴露子宮內腔，將內膜面展平在無水乙醇中浸泡30 s。PBS沖洗除去乙醇，用眼科鑷剝離子宮內膜，放入含PBS小玻璃瓶中，剪成約1 mm3組織塊。PBS清洗血液至液體清亮。

1.3.2 膠原酶消化處理

剪碎的組織塊移至10 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，除去上清后加入3倍組織體積的不同濃度Ⅰ型膠原酶(分別為0.5%，0.25%和0.125%)，搖勻后置于37 ℃培養箱中消化30 min至4 h，為使消化液與組織密切接觸，每隔10 min取出震蕩1次。組織消化完畢后加入適量DMEM/F12培養基稀釋，反復吹打懸液，分別經100目、400目細胞網篩濾去未消化的組織和上皮細胞團塊。收集濾液1 500 r/min 離心10 min，棄上清，所獲細胞沉淀即為基質細胞。用適量10% FBS DMEM/F12培養液懸浮細胞，臺盼藍計數以(3～5)×105個/mL密度鋪于細胞瓶中，輕輕搖晃均勻，置于38.5 ℃，5% CO2培養箱中培養。24 h后換新鮮培養液，除去未貼壁組織細胞，之后每2 d換液1次。

1.4 犬子宮內膜基質細胞的傳代培養與純化

與上皮細胞相比，基質細胞在傳代過程中更易被胰蛋白酶消化脫壁，再次貼壁也更快。根據這種特性，采取差時貼壁法在傳代培養時純化細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，原代犬子宮內膜基質細胞生長3～4 d鋪滿瓶底即能進行傳代；細心倒去舊上清培養液，用預熱38.5 ℃ PBS洗3次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液(含0.02% EDTA)，輕輕晃動細胞瓶，使酶溶液與細胞面充分接觸。顯微境下觀察細胞變化，直至大部分成纖維樣細胞收縮變圓后，立即加入等量完全培養基(含10% FBS)終止消化，收集消化液1 000 r/min 離心5 min，沉淀重懸，按3×105個/mL細胞密度移入新的細胞培養瓶擴增培養，培養箱中培養3 h后大部分基質細胞已貼壁，棄去上清培養液，添加新鮮培養液，即可得到進一步純化的基質細胞，CO2培養箱中靜置培養，用作細胞觀察與鑒定。

1.5 犬子宮內膜基質細胞的觀察與鑒定

1.5.1 基質細胞的顯微鏡觀察

倒置顯微鏡下每天觀察細胞不同階段的生長狀態和記錄其形態學特點。

1.5.2 免疫熒光化學鑒定細胞表型及純度

在6孔培養板中放入圓形玻片，P3代犬子宮內膜基質細胞接種于上述培養板中，細胞爬片培養2～3 d至幾乎全部覆蓋玻片，PBS小心清洗2次，用4%多聚甲醛常溫固定30 min。PBS吹打洗滌3次，0.1% TritonX-100孵育15 min，PBS洗滌3次，BSA室溫封閉30 min后加入一抗(鼠抗人波形蛋白vimentin的工作濃度為1∶200，鼠抗人細胞角蛋白CK-18的工作濃度為1∶200)，4 ℃過夜，滴加Cy3標記的羊抗鼠二抗(工作濃度為1∶100)，避光室溫孵育1 h。DAPI復染細胞核10 min。抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。每張細胞片低倍鏡下隨機選取10個視野計數細胞。

1.6 MTT檢測基質細胞增殖情況

每隔3代(P3、P6、P9、P12)用MTT法檢測犬子宮內膜基質細胞的增殖狀況并繪制細胞生長曲線。96孔板內接種細胞(1×105個/mL)，設置6個復孔，于38.5 ℃，5% CO2的培養箱中靜置培養8 d。每天觀測細胞生長狀態并采用MTT法檢測，讀取各孔在波長570 nm處的OD值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.7 凍存前后基質細胞存活率測定

將凍存前和解凍后的細胞制成細胞懸液，加入等體積0.4%臺盼藍染色3 min，混合均勻取10 μL沿蓋玻片邊緣滴入血球計數板小室，顯微鏡下觀察計數。活細胞透亮，死細胞因細胞膜通透性改變而被染成藍色。隨機選取視野，分別記錄細胞數，計算活細胞占細胞總數的百分比即為細胞活率。

1.8 數據統計與分析

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析處理，P<0.05表示差異顯著，數據以“平均數±標準誤”表示。

2 結果

2.1 不同濃度膠原酶的細胞消化效果

剪碎組織中加入不同濃度的膠原酶Ⅰ置于37 ℃培養箱作用一段時間，觀察組織的消化程度。結果發現，0.125%膠原酶Ⅰ作用1 h，液體輕度渾濁；作用2 h，組織邊緣飄出絮狀物；作用4 h左右時，組織幾乎酶解，液體為稀糊狀，易于過濾。0.25%膠原酶Ⅰ作用1 h，組織開始疏松；作用2 h左右，組織全部被酶解，液體較黏稠，較難過濾。0.5%膠原酶Ⅰ作用30 min，組織疏散成絮狀；作用1 h時組織已被酶解，液體呈糊狀，黏度高，難過濾。每隔10 min振蕩消化液，根據消化狀態靈活把控消化時間，3種酶濃度都可獲得活力較好的細胞。因體外分離細胞的過程較長，為節約試驗時間，選用0.5%Ⅰ型膠原酶消化培養60 min左右，消化完畢的消化液加入適量DMEM/F12稀釋，以便于網篩過濾。

2.2 基質細胞培養成功率與細胞產量

試驗成功分離培養出犬子宮內膜基質細胞，培養成功率較高，但從寵物醫院運輸到實驗室時間較久的樣本分離培養的細胞存活率低或極易發生污染。試驗發現，處于不同發情狀態的母犬子宮分離得到的基質細胞也有差異。絕大多數做絕育手術的母犬處于發情期，子宮角細長，子宮內膜潮紅，內腔黏液較少，其原代分離培養得到的基質細胞易貼壁生長，細胞產量高。間情期的母犬子宮松弛，子宮角較粗，剖開后內腔黏液較多，原代分離培養得到的基質細胞狀態不佳，不易貼壁，污染幾率較高，常常導致分離培養失敗。母犬發情期和間情期子宮經原代分離培養所獲基質細胞平均活率測定結果見表1。

表1 母犬不同生理階段子宮原代分離的基質細胞平均活率%

由表1可見，原代培養24 h和48 h后，分別對發情期和間情期的犬子宮內膜基質細胞進行活率檢測，結果表明發情期的犬子宮經原代分離培養所獲的細胞活率均顯著高于間情期(P<0.05)。

2.3 基質細胞形態學和生物學特征

原代培養的犬子宮內膜基質細胞接種3 h左右開始貼壁，12 h基本貼壁完全，以(3～5)×105個/mL密度接種3 d接近鋪滿。倒置顯微鏡下觀察顯示，培養24 h的犬子宮內膜基質細胞開始延伸生長，細胞薄而扁平，多數細胞呈三角型或星型(圖1A)；48 h時細胞伸長為梭形或放射狀，胞漿豐富而透明(圖1B)。

A.培養24 h(400×); B.培養48 h(100×)

用添加0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液作細胞傳代培養，消化的最適作用時間為3 min，此時可見大部分梭形細胞收縮脫壁。傳代后的基質細胞形態不變，生長迅速(圖2A)，48 h左右基本匯合，細胞之間平行排列或呈漩渦狀分布(圖2B)。隨著傳代次數的增多，基質細胞的純度也越來越高，但12代之后細胞逐漸生長緩慢，至19代時細胞幾乎不再生長。

A.培養24 h(200×);B.培養48 h(100×)

2.4 基質細胞的免疫熒光鑒定

將CK-18和vimentin 2種特異性標志分子對體外分離的犬子宮內膜基質細胞進行免疫熒光染色，即可判定細胞表型及純度。結果表明，傳代的基質細胞多呈長梭形，以vimentin染色陽性(胞漿內見紅色熒光標記)，CK-18染色陰性(胞漿內無或弱綠色熒光標記)，證實培養的細胞為基質細胞(圖3)。Vimentin陽性細胞率為(93.10±0.59)%，分離的基質細胞純度在92%～95%。

圖3 犬子宮內膜基質細胞的免疫熒光鑒定(比例尺=50 μm)

2.5 基質細胞生長曲線的繪制

犬子宮內膜基質細胞生長曲線呈現“S”型，接種后有1 d適應期，P3、P6、P9代細胞在培養第2天進入指數增長期，5 d以后細胞逐漸減少；P12代細胞推遲1 d進入指數增長期，細胞生長緩慢，由此可見，隨著傳代次數增多，犬子宮內膜基質細胞的增殖能力逐漸下降。P3、P6、P9細胞生長速率基本接近，處于增殖旺盛階段，符合正常的分裂增殖特性。

圖4 犬子宮內膜基質細胞的生長曲線

2.6 基質細胞凍存前后的存活率

分別解凍P3、P6、P9代細胞，檢測凍存前后的細胞活率見表2。P3、P6、P9代細胞凍存前均有較高的存活率，解凍后P9代細胞存活率相比前兩者顯著降低(P<0.05)。

表2 犬子宮內膜基質細胞凍存前后的平均細胞活率 %

3 討論

犬與其他哺乳動物有著不同的生殖生理特點，卵泡在發情排卵后逐漸黃體化，血液中雌激素水平下降，孕酮水平逐漸增加，并且體內的高濃度孕酮一直會持續到間情期[2]。有研究表明，母犬發情后期和間期升高的孕酮含量和降低的雌激素含量會引起子宮內膜腺囊性增生，并影響其白細胞抗感染能力[3]，蓄積的腺體分泌物和低下的自身免疫力造成了利于細菌繁殖的子宮內環境，這意味著母犬比其他動物更容易感染子宮疾病。子宮內膜主要是由基質細胞和上皮細胞組成，而增生期的子宮內膜以基質細胞為主[4]。為研究基質細胞的生理功能，本試驗優化了犬子宮內膜基質細胞分離培養程序，為研究子宮原位的作用機制、分析細胞間相互聯系及細菌的侵襲過程、研究性激素的調節作用等提供了理想的細胞模型。

絕育母犬的子宮組織離開體內后，易受到外界細菌的污染而可能導致培養失敗，因此取材必需在手術過程中無菌獲得，并保持低溫運輸盡快送達實驗室。試驗發現，發情期子宮樣本較間情期樣本所獲細胞原代培養更易貼壁，生長狀態更好，間情期子宮樣本原代培養過程狀態不佳，且容易發生污染。據報道，人子宮內膜基質細胞易受到陰道細菌污染而導致培養失敗[5]，奶牛處于間情期的子宮分離培養所獲內膜細胞活力較低[6]。這一發現推測與間情期雌性體內異常的性激素水平有關，導致細胞大小、形態及特性發生變化或子宮免疫功能降低而未能清除內膜上入侵的細菌。本試驗所取內膜多為發情期內膜，內膜基質細胞含量更高，為降低間情期子宮內膜分離培養的失敗率，適當增加了洗滌液及培養液中的青霉素、鏈霉素濃度，以最大程度減少污染。

本試驗對犬子宮內膜基質細胞的分離培養參考人[7]和各種動物的研究方法[8-12]，并對宗振平等[13]和Bartel等[14]的方法加以摸索和改良。目前，子宮內膜的分離主要采用酶消化法，酶的種類、濃度、作用時間因動物不同、細胞不同而異，酶消化法又分膠原酶消化法、胰蛋白酶消化法和混合酶消化法。前期經過多次試驗發現，胰蛋白酶對犬子宮內膜消化效果較差，消化時間短則組織塊未被完全消化，時間長則液體十分黏稠，難以過濾，且對細胞作用強、損傷大，得到的細胞量很少，而用膠原酶對細胞的影響較小，獲得的細胞易分散、活力更強，因此試驗直接用膠原酶持續消化。本研究用0.125%、0.25%、0.5%Ⅰ型膠原酶分別對組織作用消化，觀測消化時間和消化效果，結果發現，0.125% Ⅰ型膠原酶也可取得較好的消化效果，且消化液易于過濾，但需消化4 h以上； 0.5% Ⅰ型膠原酶在較短的時間內可獲得了較多的細胞，且不影響細胞的活性；0.25% Ⅰ型膠原酶的消化效果處于兩者之間。此外，需要把控好組織與消化酶的體積比(1∶3)，盡量剪碎內膜組織可減少消化酶作用時間，防止因消化酶添加過多或組織量大加長消化時間而導致過度消化，從而影響細胞的活力和貼壁情況。由于子宮內膜基質細胞分離培養步驟較多，操作時間較長，對細胞存活易產生不良影響，為了縮短細胞在體外的分離時間，減少污染概率，試驗選擇0.5% Ⅰ型膠原酶，對黏稠的消化液適當稀釋以便于更快過濾，增加活細胞的比例。

網篩過濾法是一種常用的組織細胞分離法[8，15]，根據上皮細胞體積大且易成團而基質細胞體積小且易貼壁的特點，采用100目和400目細胞篩網過濾去除未被消化組織和腺上皮細胞團，濾液離心即可獲得較純的基質細胞懸液，以較高的密度接種可增加細胞間的相互支持，降低培養失敗的概率。再根據原代上皮細胞和基質細胞的貼壁時間差異進行二次分離純化，腺上皮細胞貼壁時間較長，一般36 h后才可以首次換液，因此接種細胞24 h時需及時換液以除去上皮細胞，提高基質細胞的純度。依然混雜在基質細胞中的上皮細胞，可根據兩者對胰蛋白酶的敏感性不同，采用多次差時消化法純化出基質細胞，即使還有少量的腺上皮細胞也會因為不能耐受傳代而被除去。

試驗分離得到的犬子宮內膜基質細胞呈成纖維細胞樣，傳代細胞的生長速率比原代細胞快，第2天即進入對數生長期。P9代之前基質細胞增殖能力較強，冷凍后也有較高的存活率，細胞穩定性好，可在體外生長至19代。犬原代細胞的分離培養過程不改變細胞特異性蛋白的表達，因而可采用針對基質細胞抗原的特異性抗體對細胞進行免疫鑒定。許多學者認為細胞角蛋白只在腺上皮細胞中特異性表達，vimentin在基質細胞和腺上皮細胞中均可表達，因此，僅vimentin不能作為鑒別基質細胞與上皮細胞的依據[16-18]。利用角蛋白和波形蛋白抗體檢測和計數分析表明，試驗培養的離體細胞確為基質細胞，可以達到92%～95%的細胞純度，可用作進一步的試驗研究。

子宮內膜基質細胞是激素作用的靶器官，其分泌功能也十分復雜[19]。Wang 等[20]對人子宮內膜基質細胞進行全基因轉錄組分析，發現基質細胞經孕酮處理會促進免疫細胞群募集和血管生成，這對于成功懷孕至關重要；子宮內膜基質細胞分泌的甲狀旁腺激素相關蛋白可以作用于骨骼、腎臟等器官，有助于鈣的傳送[21]。子宮內膜基質細胞還可以表達大量細胞因子，包括血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、集落刺激因子(CSF1)、腫瘤壞死因子α (TNFα)等[22]，這些生長因子可維持機體的正常生命活動。研究發現孕酮可通過增強成纖維生成因子(FGF)的表達使小鼠子宮內膜基質細胞G1期延長,在此期間如果受到合適的介質刺激即開始分化[23]；犬子宮內膜基質細胞受大腸桿菌和脂多糖刺激后，細胞因子IL-8、CXCL5和CXCLl0分泌增加，對炎性部位嗜中性粒細胞和T淋巴細胞的募集發揮重要作用[18]。因此子宮內膜基質細胞同細胞因子的關系極為密切。

子宮內膜細胞在體內受內分泌環境等多種因素的調節，妨礙了對單一細胞的關鍵性分析。因此，體外分離純化具有同一性的子宮內膜基質細胞是研究其生長代謝、激素作用以及免疫機理的重要環節。本試驗優化了細胞分離步驟，提高了細胞產量，對犬繁殖生理與疾病的研究具有重要意義，為研究犬子宮內膜相關疾病提供了理想的細胞模型。