26種圈養珍稀鳥類性別的快速分子生物學鑒定

朱向蕾

(上海動物園，上海 200335)

性別是鳥類最重要的特征之一，鳥類的雌雄個體在生理、行為、生態等方面具有差別。鳥類的性別鑒定，特別是性別的早期鑒定對鳥類的飼養管理、繁殖與育種、遺傳疾病的防治、進化生態學、種群結構和群體遺傳分析等方面都有非常重要的意義，尤其是對瀕危珍稀鳥類的保護研究和管理具有重要作用[1-4]。為了保護生態平衡，許多動物園通過人工飼養繁育的方法來提高瀕危鳥類的存活率和繁殖率，而動物的繁殖育種均離不開性別鑒定，合理的性別比例是動物得以繁殖的必備條件之一。

全世界鳥類中有超50%的鳥類是雌雄同形的單態性鳥類，這些鳥類無論成幼均很難從外觀形態上來鑒別性別[5]。對單態性成鳥或雛鳥/亞成鳥的常規鑒定方法有：生殖器官形態學檢視、生理激素測定等，對鳥類均造成一定的應激或侵入式傷害，尤其是雛鳥、珍稀個體。因此，使用快速可靠安全的方法鑒別性別，對鳥類保育研究工作的成功開展尤為重要。

鳥類性別鑒定有很多方法，可以從身體表面的明顯斑塊、個體的行為觀察、形態學特征的差異、解剖學或腹腔鏡檢查以及性染色體的檢查等方面進行。傳統的性別鑒定方法有腹腔鏡檢查、翻肛鑒別、類固醇鑒別、核型分析等[6]。腹腔鏡檢查需要麻醉，有一定風險，對于瀕危野生動物并不適宜；翻肛鑒別需要相當豐富的經驗；利用排泄物進行類固醇鑒別耗時，準確性低；核型分析獲得結果時間較長，對于Z染色體和W染色體差異較小的鳥類不適用。隨著時代的進展，分子生物學飛速發展，性染色體的鑒定檢查趨于流行，染色體螺旋蛋白(CHD)基因屬于功能性基因，十分保守，有2個同源拷貝CHD-W和CHD-Z，在鳥類性別鑒定中發揮著巨大作用[7]。

上海動物園目前飼養有鳥類19目42科180余種，超過70%的種類為單態性鳥類，近90%的個體性別信息尚不明確。自上世紀70年代起，該園一直開展珍稀鳥類的人工飼養繁育工作。胡瑞穎等[8]已經對丹頂鶴、白枕鶴、東方白鶴等9種86只國家一級保護鳥類進行了性別鑒定，田秀華等[9]對7種鶴形目鳥類進行了性別鑒定，相關成果運用于繁育實踐，為在更廣范圍內進一步開展鳥類性別的分子鑒定工作奠定了基礎。

本研究主要通過分子生物學手段在已有研究的基礎上對鳥類的性別進行快速準確地鑒定，以便為動物園中鳥類群體的飼養管理和繁殖育種提供性別信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集上海動物園內正常飼養的部分鳥類羽毛，包括斑嘴環企鵝、鵜鶘、鶴鴕、小天鵝、鞭笞鵎鵼、鶴鸛類、鸚鵡類等共涉及9目26種258只。采集樣品均為鳥類胸部體毛，確保羽根完整，常溫干燥保存，或-80 ℃長期保存。使用含EDTA抗凝管采集鳥翅根處血液，-20 ℃冷凍保存待用。

1.2 主要試劑

使用MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit(Code No.9781)提取血液樣本組DNA，-20 ℃冷凍保存待用。MightyAmpTMDNA Polymerase Ver.3 Kit、HaeⅢ、6×Loading Buffer、50 bp DNA Ladder均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設計

參考文獻[10-11]設計引物，3對引物序列如下：P2(5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3′)、P8(5′-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3′)；2550 F(5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′) 、 2718R (5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′)[10]；K7(5′-AGGGTGTCTAGAACAAAAGAGA-3′)、W1(5′-CCTTTAAACAAGCTGTTAAAGCA-3′)[11]，引物由英濰捷基公司合成。

1.4 PCR反應與酶切反應

PCR反應體系為20 μL，其中：MightyAmp DNA Polymerase 0.4 μL，2×MightyAmp Buffer 10 μL，引物各0.6 μL，其中血液樣本DNA 2 μL或剪取1 mm長2～3段羽根，補充ddH2O至20 μL。P2/P8、2550F/2718R退火溫度為48 ℃，K7/W1采用55 ℃、50 ℃、47 ℃溫度降落式PCR，反應在PCR儀上進行。1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，產物由寶生物工程(大連)有限公司進行克隆測序。酶切體系為：HaeⅢ 0.5 μL，10×M Buffer 1 μL，PCR產物8.5 μL。37 ℃水浴過夜(16～20 h)[12]。酶切后產物經1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 羽根樣品及PCR方法的有效性驗證

以已知性別的火烈鳥和美洲紅鹮為例，分別以血液抽屜的DNA和羽根樣本作為模板，2550F/2718R為引物，擴增CHD基因片段，驗證以羽根樣品直接PCR檢測的有效性和可靠性。

產物經凝膠電泳，結果顯示2種鳥類的雄性均擴增出1條條帶，經克隆測序與NCBI GenBank序列比對，大小為663 bp；雌性均擴增出2條條帶，大小分別為663 和460 bp。兩物種血液組DNA與羽根樣本擴增結果一致，性別鑒定結果準確。從圖1觀察，以未經提取純化的羽根為模板的PCR產物，條帶清晰度和產物濃度與血液組DNA相比，無明顯差異，也無明顯非特異性擴增，可用于性別鑒定(圖1)。

1、5. 火烈鳥羽毛毛囊；2、6. 美洲紅鹮羽毛毛囊；3、7. 火烈鳥全血基因組DNA；4、8. 美洲紅鹮全血基因組DNA；M. Marker

2.2 白鵜鶘和斑嘴環企鵝的性別鑒定

利用P2/P8引物對白鵜鶘進行性別鑒定，鑒定結果如圖2所示。HaeⅢ酶切后雄性可出現1條條帶，經克隆測序與NCBI GenBank序列比對，大小為321 bp;雌性為2條條帶，大小分別為321和234 bp(圖2)。

利用P2/P8引物對斑嘴環企鵝進行性別鑒定，單純進行PCR擴增后，每個樣品均擴增出1條條帶，經克隆測序與NCBI GenBank序列比對，大小367 bp，難以判斷性別。經HaeⅢ酶切后雄性可看到2條條帶，其中明顯的一條為302 bp，最下面1條條帶較淡，未測序，大小在50～100 bp;雌性為3條條帶，多了1條大小為367 bp的條帶(圖3)。

1、3、5、7、9. P2/P8引物擴增；2、4、6、8、10. 擴增產物經HaeⅢ酶切；M.Marker

1、3、5、7、9. P2/P8引物擴增；2、4、6、8、10.擴增產物經HaeⅢ酶切；M.Marker

2.3 鶴鴕的性別鑒定

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后結果如圖4，所有樣品均擴增出1條大小約350 bp的條帶，而雌性除了350 bp大小的條帶外，多擴增1條約150 bp的條帶。

1～4. 用K7/W1引物擴增；M.Marker

2.4 檢驗樣品及引物匯總

通過PCR方法對上海動物園中9目26種258只鳥類進行了性別鑒定，其中：鸚形目、鸛形目、鶴形目及鴷形目鳥類應用2550F/2718R引物，企鵝目及鵜鶘目應用P2/P8引物，鴕形目及鶴鴕目的非平胸類鳥類應用K7/W1引物，雁形目鳥類的引物選擇根據種屬的不同選擇了不同的引物。試驗過程中檢驗樣品及引物匯總見表1。

表1 珍稀鳥類性別鑒定物種及其引物匯總

3 討論

有研究嘗試應用鳥類外部形態進行性別鑒定，如體重和尾長[15]、羽毛和大小[16]、性別特定行為和鳥喙長度[17]。與傳統方法相比，分子生物學手段鑒定鳥類性別取樣量小、準確率高、迅速、鳥類應激反應小，是開展鳥類飼養繁育、生態學、形態學等領域研究的基礎技術。隨著分子生物學的發展，利用DNA進行性別鑒定被廣泛應用，血液和羽毛均可作為樣本來源進行鑒定，為了減少對鳥類的損傷，采集羽毛可以降低鳥類的應激反應，避免了過度失血。動物園飼養的鳥類大多屬于群養，如果有足夠的籠舍可進行完善的隔離，非損傷性取樣將會是最佳的取樣方式。采集羽毛簡便易行且對研究對象幾乎無傷害，使其在對鳥類性別的分子生物學鑒定和保護遺傳學研究領域中得到廣泛的應用[18-19]。

3.1 火烈鳥

李文斌等[20]運用2550F/2718R這對引物對火烈鳥進行了性別鑒定，目的條帶分別為800 bp和600 bp左右；陳蓉等[14]也應用這對引物進行了火烈鳥的性別鑒定，目的條帶大小分別在750～500 bp，500～250 bp；本文的目的條帶經測序后是663 bp和460 bp，與陳蓉等[14]的結果一致，但與李文斌等[20]結果略有差異，可能與退火溫度有關，但并不影響結果判定。

3.2 企鵝

Zhang等[21]對帝王企鵝(Aptenodytespatagonicus)，鳳冠企鵝(Eudypteschrysocome)，金頭企鵝(Pygoscelispapua)和麥哲倫企鵝(Spheniscusmagellanicus)4種企鵝應用(2550F/2718R和P2/P8)2對引物進行了性別鑒定，結果2對引物并不適用于所有的企鵝。沈瑋等[22]應用P2/P8引物對南京海底世界的6只帝企鵝進行了性別鑒定，但是由于CHD-Z和CHD-W的大小相近，瓊脂糖凝膠電泳均顯現出1條條帶，給性別鑒定帶來了一定困難。Costantini等[12]應用P2/P8引物對洪堡企鵝(Spheniscushumboldti)進行了性別鑒定，3項研究中都沒有涉及到斑嘴環企鵝。本研究在洪堡企鵝研究的基礎上應用P2/P8引物進行擴增，擴增后均顯示1條條帶，原因在于雌雄條帶相差較小，難以區分。考慮到企鵝種間的相近性后續依舊用HaeⅢ進行了酶切，酶切后雌性可出現3條條帶(367、 302 和 50～100 bp)，不同于洪堡企鵝(380、310和60 bp)；雄性表現為2條條帶(302 和50～100 bp)，不同于洪堡企鵝(310和60 bp)。條帶大小不同顯示了物種間的差異性，但可以準確地進行性別判定，經一定數量的酶切反應試驗，以更好地進行性別的判定。袁夢[23]應用引物P2/P8對鵜鶘性別進行鑒定，經酶切結果為雄性個體擴增出1條條帶，大小為550 bp，雌性個體為2條條帶，大小分別為550和490 bp，與本文結果有差異。分析可能本研究所用樣品為白鵜鶘，可能是鵜鶘種間差異，亦或是退火溫度的影響，具體原因有待進一步研究。

3.3 鶴鴕

非平胸目鳥類的性別鑒定引物無法用于平胸目鳥類性別的鑒定，Bello等[24]利用隨機擴增多態性DNA法(RAPD)進行鴕鳥的性別鑒定，付晶等[25]建立了鴯鹋性別鑒定的分子標記方法，Huynen等[11]采用RAPD進行性別特異性標記，利用引物K1、K2、K3、K4對鴯鹋、鴕鳥等平胸目鳥類進行性別鑒定，但有時無法擴增雄性基因片段；進一步設計了W1和K7引物，該引物雌雄大小差異較大，對鴕鳥、鴯鹋的性別分析更為準確，但沒有涉及到鶴鴕。本研究在此基礎上改變了部分反應條件，縮短了變性和退火時間，降低了延伸的溫度，所得結果可以準確有效地判斷鶴鴕的性別，鶴鴕目的條帶大小與 Huynen等[11]研究結果相符，具體大小有待測序。

3.4 樣本選擇

Jensen等[2]利用全血、卵黃囊和羽毛基因組DNA對47種鳥類進行了性別鑒定，結果發現羽毛中DNA量少，且電泳結果中有非特異性條帶混入。本次研究中直接采用羽毛毛囊作為模板，未經過DNA提取與純化，減少了在 DNA提取過程中造成的損失，節約了時間和成本，提高了效率，且經過反復試驗，與全血基因組提取的性別鑒定結果完全一致，這種簡單、快速且非損傷性取樣的性別鑒定檢測方法，為以生物保護為基礎的鳥類學研究提供了實用有效的選擇。為了提高PCR反應的可重復性，減少交叉反應的風險，可在加樣過程中增加羽根的數量，不同樣本間做好采樣工具的消毒清潔工作。

綜上，本研究對動物園內部分珍稀鳥類采用分子生物學手段進行了性別鑒定，準確性高，樣品大多采用非損傷性取樣，不僅減少了對鳥類的應激，而且簡化了操作流程，提高了工作效率，并在此基礎上針對一些新物種進行了性別鑒定的檢驗，為鳥類性別鑒定積累了更多的數據。然而鳥類種類繁多，考慮到鳥類的珍稀及采樣難易程度，本研究目前涉及到9目中26種鳥類，鸮形目、隼形目、佛法僧目等鳥類有待進一步研究。

致謝：本研究在采樣及檢測過程中得到了上海動物園獸醫院桂劍峰院長，陳曉蘭、陸旖旎等獸醫，以及鳥類飼養隊組黃康寧、張志浩等同事的大力支持，在此表示感謝。