冷凍保存20年的湖羊胚胎移植復蘇與利用

劉莉君，章曉煒，馬敏彪，劉雅麗，白慧琴，朱芳賢

(1. 浙江畜牧技術推廣總站，浙江 杭州 310021；2. 浙江華麗牧業有限公司，浙江 杭州 311116；3. 全國畜牧總站，北京 100193)

湖羊是世界著名的多羔綿羊品種，具有性成熟早、繁殖力高、四季發情、前期生長速度較快、耐濕熱、耐粗飼、宜舍飼、適應性強等優良性狀，尤其是多羔性的遺傳性能穩定，攜帶FceB基因，所產羔皮花案美麗，肉質細嫩、鮮美、膻味少[1]。近幾年，西部省份陸續引進湖羊對當地綿羊進行雜交改良，證實湖羊不僅適應主產區江南濕熱氣候和密集舍飼條件，在引入新疆、甘肅等氣候干燥、冬季寒冷的大西北地區后也能正常生長繁育[2-5]。

但目前，因市場產品需求結構的調整和對湖羊開發利用的不合理，不同程度出現近親繁殖、種質退化、羔皮品質變差和產羔率下降等問題[6-7]，直接影響了湖羊產業的經濟效益和可持續發展。現有的湖羊保種以數家原種場飼養純種湖羊為主，保種形式單一、成本高、安全性保障不夠，很難保證種質穩定性，迫切需要探索其他保種方式和途徑。

為了檢驗20多年前湖羊冷凍胚胎的制作、保存質量，評價生物保種的效果，同時為保種場擴充血緣，對國家家畜基因庫提供的上世紀八九十年代保存4個血統的24枚冷凍胚胎，在國家級湖羊保種場浙江華麗牧業有限公司進行復蘇利用，對胚胎羊開展性能測定，檢驗湖羊冷凍胚胎長期保存及復蘇利用的效果。

1 材料與方法

1.1 冷凍胚胎

保存于國家家畜基因庫中的4個血統共24枚胚胎，包括：1998年于浙江余杭湖羊場制作的公247與母664組合和公285與母659組合各6枚；1999年于浙江吳興種羊場制作的公8與母808組合和公4與母704組合各6枚。

1.2 試驗用羊

2018年3月初開始受體羊選擇并單獨組群。受體羊：為了更好地進行胚胎移植后代與目前的湖羊對照，受體選擇國家級保種場的湖羊，其年齡在2～4胎、遺傳背景一致、膘情中等、健康、繁殖性能好(母性好)的空懷母羊9只；對照組羊：選擇健康、系譜記錄完整、品種特征明顯、繁殖力強且已開始配種的3個血統公羊6只，選擇年齡在2～4胎、遺傳背景一致、膘情中等、健康、繁殖性能好(母性好)母羊20只，采用自然交配方式受孕。

1.3 主要試劑

孕酮陰道栓(CIDR)，新西蘭DEC國際有限公司生產，1.9 g/支，批號2017.11.20；氯前列烯醇(PG)，上海市計劃生育科學研究所生產，每支0.2 mg，批號2017.06.13；孕馬血清促性腺激素(PMSG)，寧波三生藥業有限公司生產，1 000萬U/支，批號2016.12.15。

1.4 受體羊同期發情處理

采用CIDR+PG+PMSG同期化處理。放栓日為第1天，放栓后第12天撤栓，同時注射PG 1支(0.2 mg)、PMSG 300 U，撤栓后24 h觀察發情(用試情公羊試)。

1.5 胚胎解凍和鑒定

從液氮罐中取出裝有胚胎的細管，室溫下空氣浴10 s后投入32～35 ℃水浴中2 min。用消毒衛生紙擦干細管，剪去封口端，將胚胎推入培養皿中，然后將胚胎依次移入6%、3%、0%甘油的0.1 mol/L蔗糖PBS解凍液中，分別停留5 min，最后用保存液洗3次，鏡檢。

發育正常的胚胎，其卵裂球輪廓清晰，明暗度適中，細胞密度大，卵裂均勻，細胞變性率不超過10%為A級；胚齡與發育期基本吻合，輪廓清晰，明暗適中或稍暗或稍淡，細胞密度較小或小型卵型球過多，細胞變性率10%～20%為B級；輪廓不清晰，色澤過暗或者過淡，細胞密度小，細胞變性率為30%～40%為C級；退化胚、變性胚為D級。

1.6 胚胎移植

2018年4月11—12日進行胚胎移植。受體羊術前需空腹12～24 h，仰臥或側臥于手術保定架上，肌注0.5 mL的2%靜松靈。將羊手術架后端提高。刀口位置左側在距兩側乳房的10～15 cm用刀片切開2個小口，通過腹腔內窺鏡探頭，觀察卵巢上黃體的變化以確定可否移植。每個受體移植2～3枚胚胎。

1.7 妊娠檢查

移植前4周開始加強飼養管理，術后當天給水及草料，第2天放回羊舍，每天觀察并記錄，增強營養。 2018年6月4—5日，對29只試驗母羊開展B超妊娠檢查，并對確認懷孕的母羊個體進行拍照存檔。8月24日，再次確認妊娠結果，并補拍了懷孕母羊個體照片。

1.8 初生羔羊體型外貌鑒定和等級評定

根據GB 4631—2006[8]對 2018年8月29日—9月14日陸續出生羔羊的花紋類型、花紋面積、花紋寬度、毛長、花紋緊密度、羔皮等級進行鑒定并給予等級評定。

1.9 配種

2019年6月25日起，通過家系全覆蓋，同質選配，公羊在品質和等級方面不低于母羊的原則，對胚胎羊進行交叉配種。

1.10 數據統計與分析

數據采用SPSS軟件進行單因素方差分析，各組間采用 Duncan氏法多重比較進行差異顯著性檢驗。以P<0.05作為差異顯著的標準，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 胚胎形態鑒定、移植及復蘇

共解凍胚胎24枚，其中：1級胚胎8枚，2級胚胎8枚，3級胚胎3枚，4級胚胎3枚。按3級以上為有效胚胎計，冷凍胚胎恢復利用率達到79.2% (19/24)，1級胚胎率達到33.3%(見圖1)。對9只符合移植的受體母羊進行移植，6只懷孕分娩，受胎率為66.67%；共移植胚胎22枚，出生9只羔羊，胚胎移植產羔率41%。

A. ♀659×♂285；B. ♀664×♂247；C. ♀808×♂8； D. ♀704×♂4，其中：2～6、9～11為A級胚，1、7～8、12、14～18為B級胚，19、21～24為C級胚，13、20為D級胚

2.2 冷凍胚胎復蘇繁育羊性能測定

出生冷凍胚胎復蘇繁育羊(以下簡稱胚胎羊)9只，成活8只(4公4母)，成活率88.89%，其中1只為胎產3羔之一體弱而死，成活羊健康狀況良好。從表1可以看出，8只胚胎羊均具有波形花紋且面積都在2/4以上，甲級羔皮等級率為37.5%，6只達到了等級評定的標準；對分屬于不同家系的3只公羊與4只母羊進行交配，生產9只羔羊，成活8只，公母羊繁殖性能均正常。

表2中，公羊和母羊初生重都顯著高于對照組(P<0.05)，母羊斷奶重極顯著高于對照組(P<0.01),公羊6月齡體重和體長顯著高于對照組(P<0.05)，其他體重和體尺指標和對照組沒有差異。

對胚胎羊后代進行了初生體型外貌評定，從表3可以看出，6只羔羊體型外貌特征均符合國家標準，等級評定1級以上的有3只。表4中，后代母羊組初生重顯著低于胚胎羊(P<0.01)，甲級羔皮等級率為50.00%。

表1 8只胚胎羊初生體型外貌評定

表2 胚胎羊與對照組羊生長性能比較

表3 胚胎羊后代初生體型外貌評定

表4 胚胎羊與其后代羊對比

3 討論

3.1 胚胎形態鑒定、移植及復蘇

胚胎超低溫冷凍保存的原理是在極低的溫度(液氮-196 ℃)下保存動物胚胎。處于超低溫下的胚胎，其新陳代謝幾乎完全停止，因而可以達到長期保存的目的。自Whittingham等1972年最早報道小鼠胚胎在-196 ℃和-269 ℃條件下冷凍保存獲得成功以來，人們先后在牛(Wilt和Rowson，1973)、綿羊(Willadsem等，1976)、山羊(Bilton和Moor，1976)、馬(Yamamoto，1982)、豬(Hayashi等，1989；Kameyama，1990)等試驗動物以及羚羊、狗、狒狒、猴和人上獲得成功，并得到移植后代[9-10]。1998年，朱士恩等[11]將小鼠擴張囊胚分別在液氮中冷凍保存1 h、1年和2年，解凍后囊胚形態學恢復率分別為100%、98%和98%，該研究說明保存時間對胚胎活力沒有顯著影響。本試驗的冷凍胚胎恢復利用率達到91.67%，1級胚胎率達到33.3%，也印證了這一點。本次試驗胚胎冷凍時間20年，是國內凍存時間最長的，試驗結果證實湖羊冷凍胚胎保存20年后再移植，仍然取得很好的妊娠效果。胚胎冷凍保存超過10年后移植在中國還未見報道，1974年，Whittingham等報道對小鼠胚胎的長期冷凍試驗，將小鼠胚胎的冷凍時間延長到8個月，并對胚胎進行異地移植，獲得成功。1994年，王光亞等[12]對奶山羊的胚胎進行長期冷凍保存試驗，將冷凍保存的時間延長到819 d，并成功獲得成活羔羊。2011年，尹?？频萚13]報道對冷凍8年的布爾山羊胚胎移植成功。

3.2 胚胎羊適應性

本次試驗對胚胎羊進行了初生鑒定、生長發育及繁殖性能等測定發現，初生重與對照組羔羊初生重差異較明顯，是因為胚胎移植羊胎產羔羊數少、初生體重大的原因。胚胎羊6月齡體重和體尺高于對照組，可能也是胚胎移植羊胎產羔羊數少，初生體重、體型就稍大，同等營養水平生長下，體重、體型一直略微高于對照組?？傊咛パ蚋黜楏w重和體尺指標與對照組生長發育一致，至6月齡無死亡、健康無病，以及4只母羊均成功懷孕并產羔，同胞胎數雙胎以上75%，同胞數基本符合湖羊多胎的特性，后代初生重正常，健康狀況良好，這些都說明胚胎羊適應性正常。從胚胎移植羊及后代等級評定情況看，1級以上等級占比高于目前湖羊種羊整體情況，同時我們分析了1989年保種場湖羊的甲級羔皮率，也是34%，而胚胎羊是37.5%，表明冷凍胚胎保持了當年湖羊的特性。

4 結論

本研究對保存20年的湖羊胚胎進行復蘇，并連續跟蹤近2年，對胚胎羊生長、繁殖性能進行測定，發現冷凍達20年湖羊的胚胎經解凍移植復蘇后，仍有很好的復蘇率，其生長發育、生產性能及繁殖性能與自然交配的湖羊基本保持一致，體型外貌鑒定符合純種湖羊特征，保持了湖羊原來的特征。研究證實了湖羊胚胎制作、復蘇、利用技術應用取得預期效果，這是畜禽保種技術和保種方法的重大突破，對地方品種遺傳資源的保種具有深遠意義，說明了生物保種是可行的。