非手性-手性色譜-預測多反應監測法分析中藥毛前胡的化學成分

許 霞, 李 婷, 賈金茹, 湯慧婷, 李 軍, 趙云芳, 宋月林

(北京中醫藥大學, 中藥學院中藥現代研究中心, 北京 100029)

中藥毛前胡(Ligustici Radix)為傘形科植物短片藁本(LigusticumbrachylobumFranch.)的干燥根,其性溫,味甘、辛,入肝、脾、膀胱三經,主要用于治療風熱咳嗽痰多、痰熱喘滿、咯痰黃稠等證[1]。毛前胡植物形狀、功能主治與中藥前胡(Peucedani Radix)均相似,常被用作前胡的替代品,但因其根莖部密布較為堅硬的殘存葉鞘纖維,難以除凈,故藥材稱為毛前胡。國內外對其化學成分研究較少,制約了毛前胡的深度開發。因此,本研究對其化學成分進行深入闡明,以期為其進一步開發利用提供理論依據,同時也為其他傘形科中藥中香豆素類成分分析提供借鑒。利用課題組前期[2-4]建立的中心切割非手性-手性二維液相色譜-串聯質譜系統(heart-cutting achiral-chiral 2D LC-MS/MS)以及直接進樣-三維質譜法(DI-3D MS)對前胡和毛前胡的化學成分進行了系統的對比分析,通過比較各信號峰的多級質譜數據和保留時間,發現毛前胡的主要化學成分與前胡類似,均以順式角型吡喃香豆素(即為順式凱琳內酯衍生物)為主,且含有多組對映異構體。對前胡而言,多對對映異構體之間的含量差異性大,表現為對映異構體過量的現象[5],并且對映異構體間往往呈現出藥理活性[6]和代謝[7]差異。我們推測毛前胡中的這些對映異構體也并非以外消旋體的形式存在,而是其中一種構型含量較高,通常稱為優映體。因此,在對中藥毛前胡進行化學成分深入分析時,應對其對映異構體進行立體選擇性分離,明確對映體之間的含量比例,從而更好地實現質量控制。

近年來,一些新興的色譜填料技術例如核-殼顆粒[8]、亞微米顆粒[9,10]和整體柱[11,12],使得LC的分離能力得到了顯著提高,尤其是核-殼色譜柱因其具有更高的柱效、更低的反壓以及更高的分析效率,為中藥中結構類似物和非對映異構體的化學選擇性分離提供了保障。手性色譜柱快速發展,多種涂敷型、鍵合型手性色譜填料[13]的不斷涌現使得絕大多數對映異構體都可以實現立體選擇性分離。然而,手性色譜柱往往具有較差的化學選擇性分離能力[13],而RP-C18色譜柱雖然具有高效的化學選擇性分離能力,但無法實現對映異構體的手性分離。

本研究將反相非手性色譜柱和手性色譜柱通過聚醚醚酮管線在線連接,該系統結合了RP-C18色譜柱的高效化學選擇性分離能力和手性色譜柱的立體選擇性優勢,有效避免中心切割非手性-手性二維液相色譜-質譜聯用系統的缺點,以期同步實現中藥毛前胡化學成分的化學選擇性和立體選擇性分離。同時,充分利用類似中藥(如前胡等)化學成分研究成果[2],進而采用三重四極桿質譜特有的預測多反應監測(predictive MRM)模式[14-16]實現化學成分的高靈敏度、高選擇性分析。利用該系統從中藥毛前胡中鑒定了其中60個化學成分,包括4個氨基酸類(AAs)、43個角型吡喃香豆素類(APs)、10個線型呋喃香豆素類(LFs)、2個線型吡喃香豆素類(LPs)以及1個簡單香豆素類(SC)化合物。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

U-3000雙三元色譜儀,配備兩個三元泵(即左泵和右泵)、自動進樣器、柱溫箱和紫外檢測器(美國Thermo Fisher公司); SCIEX 5500 Qtrap質譜儀(美國Sciex公司); Milli-Q超純水凈化系統(美國Millipore公司); Mettler ME204型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);超聲波清洗器(南京壘君達超聲電子設備有限公司); Premixer Assy混合器(日本Shimadzu公司)。

色譜級和質譜級甲醇、乙腈以及質譜級甲酸均購自美國Thermo Fisher公司;實驗用水由Milli-Q純水系統制備;其余試劑均為分析純,由北京化工廠提供。中藥毛前胡購于北京同仁堂,經北京大學屠鵬飛教授鑒定為傘形科植物短片藁本LigusticumbrachylobumFranch.的干燥根。標本存放于北京中醫藥大學中藥學院中藥現代研究中心。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理

取干燥的毛前胡藥材,粉碎機粉碎,過20目篩。精密稱取1.0 g粉末樣品,置具塞錐形瓶中,加入70%(v/v)甲醇水溶液50.0 mL,密塞,超聲提取30 min,放冷再次稱重,用70%(v/v)甲醇水溶液補足失重,以12 000 r/min的轉速離心10 min,取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾,取續濾液500 μL,待測。

圖 1 非手性-手性液相色譜-串聯質譜系統構建示意圖Fig. 1 Connectivity sketch of achiral-chiral LC-MS/MS platform Solvent A: 0.1% formic acid aqueous solution; solvent B: acetonitrile.

1.2.2液相色譜條件

Achiral-chiral LC-MS/MS系統各模塊連接示意圖如圖1所示。使用聚醚醚酮管將非手性柱和手性柱在線連接,利用Premixer Assy混合器將非手性柱洗脫液與左泵流動相充分混合。非手性色譜柱:Capcell core RP-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm,日本Shiseido公司);手性色譜柱:AD-RH色譜柱(150×4.6 mm, 5.0 μm,日本Daicel公司)。右泵輸送溶劑A(0.1%(v/v)甲酸水溶液)和溶劑B(乙腈),梯度洗脫程序為:0～4.0 min, 10%B; 4.0～15.0 min, 10%B～25%B; 15.0～23.0 min, 25%B～50%B; 23.0～28.0 min, 50%B～57%B; 28.0～34.0 min, 57%B～67%B; 34.0～44.0 min, 67%B～68%B; 44.0～56.0 min, 68%B; 56.0～60.0 min, 68%B～95%B; 60.0～60.1 min, 95%B～10%B; 60.1～66.0 min, 10%B;總流速為0.3 mL/min。左泵輸送溶劑A和溶劑B,梯度洗脫程序為:0～4.0 min, 95%B～86%B; 4.0～15.0 min, 86%B～70%B; 15.0～23.0 min, 70%B～50%B; 23.0～28.0 min, 50%B～47%B; 28.0～34.0 min, 47%B～43%B; 34.0～44.0 min, 43%B～42%B; 44.0～56.0 min, 42%B; 56.0～60.0 min, 42%B～21%B; 60.0～60.1 min, 21%B～95%B; 60.1～66.0 min, 95%B;總流速為0.7 mL/min。進樣體積為3 μL,色譜柱均置于35 ℃柱溫箱中。

1.2.3質譜條件

手性色譜柱洗脫液直接導入三重四極桿質譜進行分析。電噴霧電離(ESI)源,正離子模式,預測多反應監測模式檢測各化學成分。電噴霧電壓:5 500 V;離子化溫度:550 ℃;霧化氣壓力(GS1): 379.2 kPa;輔助氣壓力(GS2): 379.2 kPa;氣簾氣壓力(CUR): 241.3 kPa。Q1和Q3均為單位分辨率(0.6～0.8 Da)。預測離子對(Q1>Q3)及相關質譜參數(脫簇電壓(DP)和碰撞能(CE))如表1所示,每個離子對的采集時間(dwell time)為10 ms。

由于對映異構體質譜行為完全一致,因此本研究對于每個化合物均采用兩對離子對進行檢測,并利用定量和定性離子對豐度比值(QQR)判定兩個色譜信號是否為對映異構體[23,24]。利用數據依賴性采集模式觸發增強子離子掃描(EPI)模式記錄各母離子的MS2圖譜。EPI實驗參數為:CE, 40 eV;碰撞能量分散(CES), 35 eV。利用Analyst 1.6.2軟件對數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 液相條件的優化

課題組前期在建立反相色譜和親水作用色譜直接耦聯系統[25,26]時發現,通過選擇內徑小、柱效高的反相色譜柱作為前端色譜柱可以達到較好的分離效果。本實驗篩選并考察了多個候選色譜柱,如ACE UltraCore 2.5 Super C18(150 mm×2.1 mm, 2.5 μm,英國Advance Chromatography Technologies公司)、Waters Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Waters公司)、Ascentis?Express F5 (150 mm×3.0 mm, 2.7 μm,美國Sigma-Aldrich公司)、Capcell core RP-C18(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm,日本Shiseido公司)等多款核殼型或新型填料高效色譜柱,以色譜峰形、分離度作為指標衡量色譜柱的分離效能,最終選擇Capcell core RP-C18色譜柱作為前端化學選擇性分離柱。

進一步優化非手性柱流動相流速(0.15、0.20、0.30和0.35 mL/min)和手性柱流動相流速(0.60、0.70和0.80 mL/min)、流動相的洗脫程序以及在水中加入甲酸的體積分數(0%、0.05%、0.10%和0.15%)。最終選定0.1%甲酸作為水相的添加劑；非手性柱和手性柱的流速分別為0.3 mL/min和0.7 mL/min；具體洗脫程序見1.2.2節。

前期研究表明,AD-RH色譜柱[3,7,27]對APs對映異構體有較好的分離效果,其反相分離機制與前端色譜柱能夠很好地兼容。在APs中,C-3′和C-4′取代基團的大小會影響對映異構體的分離效能,且取代基團越大,分離效果越差,需要采用較低比例的有機相和較長的洗脫時間才能達到較好的分離。因此,在洗脫過程中逐步降低流動相的比例,且在RP-C18和AD-RH色譜柱之間引入稀釋泵,可以對含有大取代基團的對映異構體實現良好的色譜分離。對映異構體在AD-RH手性色譜柱上的流出順序決定于手性中心與表面涂敷有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅膠之間的作用力[28]。課題組前期研究[3]發現,(3′S,4′S)構型的對映異構體與固定相的作用力小于其(3′R,4′R)對映異構體,其被率先洗脫出來。因此,毛前胡中具有較小保留時間的對映異構體構型被認為是(3′S,4′S)構型,為了表述方便,以下簡稱為3′S構型。

2.2 多反應監測模式的條件優化

結合已經報道[29]的質譜裂解規律及MRM離子對信息,筆者首先對預測離子對的化學結構進行驗證,進而采用預測多反應監測模式檢測各化學成分,并利用EPI模式獲取化合物的二級質譜信息,結合碎片離子對化合物進行鑒定。前期研究[2]表明,毛前胡中所含的化學成分與前胡相似,不同成分的含量差異大,其中含量較高的APs可能會影響微量化合物的檢出。因此,本實驗引入在線能量分辨質譜法[30,31]對各化合物的碰撞能進行優化,采用非最優碰撞能抑制高含量成分的質譜響應,從而實現所有化合物的檢出。

2.3 對映體異構體判別

實驗通過QQR判定是否為對映異構體[23,24],結合對映異構體在achiral-chiral LC系統上的保留時間大于在單柱RP-C18色譜柱上的保留時間,經過驗證,發現順式-凱琳內酯(CKL, 7和8(表1中化合物的順序編號))、前胡香豆素G(QC-G, 10和11)、順式-北美芹素(Pte, 35和43)、白花前胡甲素(PA, 37和44)、順式-3′-異戊酰-4′-乙酰凱琳內酯(IAK, 42和46)、白花前胡乙素(PB, 52和54)、白花前胡素E (PE, 55和56)和順式-3′,4′-雙異戊酰凱琳內酯(DIK, 57和58)共計8對對映異構體,所有對映異構體在非手性-手性色譜耦聯系統上均能較好地手性分離(見圖2),除前胡香豆素G為LFs外,其余均為APs。如化合物順式-北美芹素(35和43)為CKL的衍生物,在角型吡喃香豆素母核的C-3′和C-4′分別為乙酰基和當歸酰基取代,分子式為C21H22O7,預測離子對包括m/z409.12>327.12、409.12>287.09、409.12>245.07、409.12>227.07,利用數據依賴性采集模式觸發EPI,獲取母離子的二級質譜信息,驗證化合物的結構。選擇m/z409.12>227.07和409.12>245.07作為定量離子對和定性離子對,化合物L-Pte和D-Pte的QQR均為2.36,根據兩者的保留時間,鑒定L-Pte和D-Pte分別為3′S和3′R構型。化合物順式-北美芹素的疊加選擇離子流圖和二級質譜圖如圖3a和3b所示。

表 1 中藥毛前胡化學成分在非手性-手性色譜-預測多反應監測系統上的質譜信息

表 1 (續)

圖 2 采用(a)非手性色譜-串聯質譜和(b)非手性-手性色譜-串聯質譜時毛前胡的選擇離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of Ligustici Radix using (a) achiral LC-MS/MS and (b) achiral-chiral LC-MS/MSPeaks 1-60 are the same as that in Table 1.

圖 3 順式-北美芹素的(a)疊加選擇離子流色譜圖和(b)二級質譜圖Fig. 3 (a) Overlaid extracted ion current chromatograms and (b) MS2 spectrum of pteryxin

2.4 毛前胡結構鑒定及質譜裂解規律

2.4.1化學成分定性分析

圖 4 白花前胡甲素的(a)質譜圖和(b)可能的裂解途徑Fig. 4 (a) MS spectrum and (b) proposed fragmentation pathways of PA

利用建立的非手性-手性色譜-預測多反應監測系統采集毛前胡在正離子模式下的質譜信息,結合碎片離子信息、文獻對比、數據庫搜索以及質譜裂解規律推導,對所有響應值大于1 000 cps,且信噪比(S/N)大于100的信號進行結構確認,初步鑒定了其中60個化學成分,包括4個AAs、43個APs、10個LFs、2個LPs以及1個SC化合物。各化合物的保留時間、主要碎片離子、預測離子對以及可能的化學成分見表1。

在正離子模式下,香豆素類化合物易產生準分子離子峰[M+H]+或加合離子峰[M+Na]+及[M+NH4]+。APs主要為順式凱琳內酯的衍生物,大部分APs通過C-3′和C-4′的羥基結合不同的取代基形成不同的化合物,常見的取代基有乙酰基、當歸酰基、巴豆酰基、千里光酰基、正丁酰基、異戊酰基等。對于LFs來說,主要通過C-5和C-8或C-3′和C-4′上取代基的不同,形成不同的化合物,如異戊烷氧基、甲氧基、糖基等。以下對毛前胡中的主要化學類型的質譜裂解規律以及各化學成分的鑒定過程進行分述。

2.4.2角型吡喃香豆素類

從毛前胡提取物中共鑒定出43個APs成分,大部分為順式凱琳內酯的衍生物。對于APs來說,C-4′取代基處于香豆素母核的芐位,可與香豆素母核形成大的共軛體系,得到更穩定的子離子。通過丟失C-3′和C-4′位的取代基,形成m/z245.07特征性碎片離子,并進一步通過中性丟失水分子形成另一個m/z227.07特征性碎片離子。例如,PA在C-3′和C-4′位置分別有一個當歸酰基和乙酰氧基取代,分子式為C21H22O7,最顯著的準分子離子峰為m/z409.12 [M+Na]+。化合物裂解時,首先從C-4′中性丟失一分子乙酰氧基(60 Da),形成豐度最高的碎片離子m/z327.12 [M+H-CH3COONa]+、進而丟失C-3′取代基(C4H6CO, 82 Da),形成特征碎片離子m/z245.08 [M+H-CH3COOH-C4H6-CO]+,隨后進一步中性丟失一分子水,最終形成m/z227.07 [M+H-CH3COOH-C4H7COOH]+的特征碎片離子。PA的質譜圖和可能的裂解途徑如圖4所示。

2.4.3線型呋喃香豆素類

除APs外,毛前胡中還含有少量的LFs化學成分,其中包括一對對映異構體QC-G (10和11)。質譜裂解規律主要由C-5、C-8或C-3′、C-4′取代基的不同而產生,常見的取代基有異戊烷氧基、甲氧基、羥基、糖基等。

C-5或C-8取代基首先通過中性丟失形成m/z203.05碎片離子,隨后進一步中性丟失CO (28 Da)和CO2(44 Da),分別產生m/z175.04和159.03的特征性碎片離子[21]。C-3′或C-4′取代的化合物,通過中性丟失C-3′或C-4′上的取代基,形成m/z247.08和229.20的特征性碎片離子[19]。如紫花前胡苷,準分子離子峰m/z409.08 [M+H]+,分子式為C20H24O9, C-3′有葡萄糖基取代,中性丟失一分子葡萄糖殘基,產生m/z247.08 [M+H-C6H10O5]+的碎片離子,隨后,進一步丟失一分子水,形成m/z229.20 [M+H-C6H10O5-H2O]+的特征性離子。紫花前胡苷質譜圖和可能的裂解途徑如圖5所示。

圖 5 紫花前胡苷的(a)質譜圖和(b)可能的裂解途徑Fig. 5 (a) MS spectrum and (b) proposed fragmentation pathways of nodakenin

2.5 非手性-手性色譜-預測多反應監測法優缺點

非手性-手性色譜耦聯系統結合了RP-C18的高效分離能力以及手性色譜柱的立體選擇性優勢,可以同步實現化合物的化學選擇性和立體選擇性分離。相比較于中心切割非手性-手性二維液相色譜而言,非手性-手性色譜耦聯系統具有儀器配置簡單、重復性好、精密度高的優點。然而,該系統也存在一定的缺點,如分離機制復雜,因為每個化合物都要經歷2個色譜柱;尋找最佳的洗脫條件是一個具有挑戰性的任務,因為輸送溶劑最少需要4個泵;二維色譜柱的要求高,要兼顧一維色譜柱的洗脫能力等。

3 結論

中藥中廣泛存在對映異構體,這些對映異構體往往具有不同的生物活性,從而發揮不同的治療效果。全面闡明中藥的化學成分組成,深入揭示對映異構體的含量差別將會使藥物更好地發揮藥理活性。本研究建立了非手性-手性色譜-預測多反應監測法,實現了中藥毛前胡的化學成分解析,揭示了其對映異構體的含量差異。本研究將為含有對映異構體的中藥及其他復雜樣品的深入定性、定量分析提供可靠的方法。